IHC全流程操作视频

石蜡切片IHC-P实验操作流程

1.脱蜡至水

在对石蜡切片染色前，须进行脱蜡处理，才能使切片顺利染色。

1）二甲苯Ⅰ 10分钟；

2）二甲苯Ⅱ 10分钟；

3）二甲苯Ⅲ 10分钟；

4）无水乙醇Ⅰ 3分钟；

5）无水乙醇Ⅱ 3分钟；

6）95%酒精 3分钟；

7）流水冲洗 3分钟。

2. 抗原修复

抗原修复方式常用的有高压修复、水煮修复、酶修复；常用的修复溶液有柠檬酸溶液（pH 6.0）、EDTA溶液（pH 9.0）、Tris-EDTA（pH 9.0）、胰酶、胃蛋白酶等。

1）水煮修复：高温容器中加入适量 1×Tris-EDTA（pH9.0）/ 柠檬酸（PH6.0）缓冲液，电磁炉加热使其沸腾3-5分钟确保低火下无气泡；将组织切片放入容器内，电磁炉调至低功率维持温度在90-95℃煮20分钟，盖上锅盖。室温冷却10分钟后，流水冲洗冷却至室温。（对于骨等容易脱片的组织，可采用60℃过夜修复。）

2）高压修复：高压锅中加入适量1×柠檬酸（pH6.0）缓冲液，不加盖加热至沸腾，将组织切片放入高压锅内，加阀、加热至均匀喷气后，维持2分钟，室温冷却10分钟后，待压力阀落下打开高压锅盖，流水冲洗冷却至室温。

注：本方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。

3）酶修复：切片稍甩干后用滤纸将组织周围的水擦干，用组化笔在组织周围画圈（防止抗体流走，注意组化笔尖不能沾水，画的圈要大小适中，距离组织0.5cm左右），在圈内滴加胰酶工作液覆盖组织，切片平放于湿盒内室温孵育20分钟，蒸馏水浸洗3次，每次3分钟。

注：抗原修复的原因：在甲醛或多聚甲醛固定过程中，组织中部分抗原发生了蛋白之间交联及醛基的封闭作用，从而失去抗原活性。通过抗原修复，可以使得细胞内抗原决定簇重新暴露，提高抗原检测成功率。

3、免疫组织化学染色

1）纯水清洗切片三次，每次5分钟。

2）阻断：切片放入3 % 过氧化氢水溶液中，孵育10分钟。

注：阻断原因：组织中的粒细胞、单核细胞及红细胞等存在内源性过氧化物酶，这些酶和辣根过氧化物酶一样，可与显色剂DAB、AEC起反应而造成假阳性，消除内源性过氧化物酶的方法是用过氧化氢溶液阻断。

3）用纯水清洗切片两次，每次5分钟。

4）切片稍甩干后用滤纸将组织切片周围的水擦干，用组化笔在组织周围画圈，在圈内滴加1%BSA配制的10%阴性山羊血清，覆盖组织，室温封闭1h。

5）清除封闭液，然后每个切片加入用推荐的抗体稀释剂稀释的一抗（通常100μL/组织），置于湿盒室温孵育1h。

6）清除抗体溶液，用1×TBST浸洗3次，每次5分钟。

7）切片拍干后在圈内滴加羊抗兔或鼠二抗（HA1119或HA1120）覆盖组织，置于湿盒室温孵育20分钟。

*HA1119（HRP Conjugated Goat anti-Rabbit IgG UltraPolymer Goat Polyclonal Antibody）

*HA1120（HRP Conjugated Goat anti-Mouse IgG UltraPolymer Goat Polyclonal Antibody）

8）1×TBST浸洗3次，每次5分钟。

9）DAB显色：切片拍干后在圈内滴加新鲜配制的DAB显色液，显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色，观察至出现阳性信号或显色5分钟，用盛有自来水的洗瓶或DAB专用烧杯冲洗玻片终止显色，自来水流水冲洗5-10分钟。

注：DAB试剂有潜在致突变作用，配制及显色时需戴双层手套防护，DAB显色后使用专用洗涤烧杯，不与其他烧杯混用。

4、复染脱水

1）苏木素 10分钟；

2）流水冲洗 3分钟；

3）促蓝 1分钟；

4）流水冲洗 3分钟；

5）95%酒精Ⅰ 1分钟；

6）95%酒精Ⅱ 1分钟；

7）95%酒精Ⅲ 1分钟；

8）无水乙醇Ⅰ 1分钟；

9）无水乙醇Ⅱ 1分钟；

10）二甲苯Ⅰ 1分钟；

11）二甲苯Ⅱ 1分钟；

12）烤箱65℃ 2分钟。

*试剂须定期更换，促蓝液变色可提前更换。

5、封片

中性树胶封固。

注：整个操作过程应保持切片处在湿润环境中，避免切片变干，否则极易产生非特异染色。

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