多重免疫荧光（mIHC）操作流程

1.样本预处理

切片烤片：将石蜡/冰冻切片放置于温度设置为 65℃的烘箱烘烤过夜（＜16h）。

切片复水：

a）石蜡切片脱蜡至水：将切片依次放入放置二甲苯-1、二甲苯-1’、二甲苯-1”的染色缸，各浸泡 5分钟。后续依次将切片放入放置无水乙醇-1、无水乙醇-1’、无水乙醇-1”，95%乙醇，85%乙醇，75%乙醇的染色缸，各浸泡 3分钟。最后将切片放入放置纯化水的染色缸，依次更换纯化水，洗涤 3 次，每次 3分钟。

b）冰冻切片复水：待冰冻切片恢复至室温（21~25℃）后，将切片放入放置 PBS 溶液的染色缸，依次更换 PBS 溶液，洗涤 3 次，每次2分钟。

抗原修复：如需修复，可采用下述两种修复方式（也可根据样本情况选择不修复）

微波修复：透明烧杯中加入适量 1×柠檬酸（PH6.0）缓冲液（根据切片数量调整），放入组织切片后置于微波炉内，大火加热至沸腾，约3分钟；室温冷却30分钟后，自来水流水冲洗冷却至室温。

阻断内源性过氧化物酶：使用免疫组化笔在组织周围画上阻水圈，保证后续添加的试剂能够完全均匀覆盖组织，防止干片。依次将画好阻水圈的切片平铺于保湿盒内，滴加适量内源性过氧化氢酶阻断剂完全均匀覆盖组织，常温避光孵育 10分钟。将切片放入放置 PBS 溶液的染色缸，依次更换 PBS 溶液，洗涤 3 次，每次 2分钟。

2.第一个指标染色

一抗孵育：

用配制好的一抗稀释液将抗体稀释到各个一抗对应的浓度后，依次将切片正面朝上平铺于保湿盒内，滴加适量稀释后的一抗完全均匀覆盖组织，28℃±2℃避光振荡孵育 20-30分钟。

将切片放入放置 PBS 溶液的染色缸，依次更换 PBS 溶液，洗涤 3 次，每次 2分钟。

二抗孵育：

根据一抗的种属选择对应种属的[TSA-HRP（R）]或[TSA-HRP（M）]，依次将切片正面朝上平铺于保湿盒内，滴加适量的[TSA-HRP（R）]或[TSA-HRP（M）]完全均匀覆盖组织，28℃±2℃避光振荡孵育 20-30分钟。

将切片放入放置 PBS 溶液的染色缸，依次更换 PBS 溶液，洗涤 3 次，每次 2分钟。

TSA 显色反应：

将[TSA Diluent]：PBS溶液按照1:299 的比例稀释，颠倒混匀 3 次左右，得到TSA Diluent稀释液。

继续将Cyclic-480：TSA Diluent稀释液按照1:250-1:500 的比例稀释。

依次将切片正面朝上平铺于保湿盒内，滴加适量稀释后的Cyclic-480完全均匀覆盖组织，常温避光孵育 5-10分钟。

将切片放入放置 PBS 溶液的染色缸，依次更换 PBS 溶液，洗涤 3 次，每次 2分钟。

荧光显微镜下观察是否有特异着色，确定特异着色后再进行下一指标染色。

抗体洗脱（根据需求，选择以下两种方式其一）：

a）高温洗脱：

将[Citrate Antigen Retrieving Buffer]：纯化水为 1:49 的比例稀释，混匀后倒入染色缸。

将切片放入染色缸中，使用微波炉最大功率加热3±1分钟，加热到染色缸里的试剂出现小气泡后转入提前预热至95℃的恒温水浴锅中，保持 95℃以上放置10-15分钟。

拿出染色缸放置于振荡器，常温自然冷却至室温。

将切片放入放置 PBS 溶液的染色缸，依次更换 PBS 溶液，洗涤 3 次，每次 2分钟。

b）温和洗脱：

依次将切片正面朝上平铺于保湿盒内，滴加适量的 60℃预热的[1x Ab Stripping Buffer]完全均匀覆盖组织，28℃±2℃避光孵育10-20分钟。

将切片放入放置 PBS 溶液的染色缸，依次更换 PBS 溶液，洗涤 3 次，每次 2分钟。

注：本方法仅适用于：洗脱后标记的抗体，与此前标记的抗体种属来源不同（不含高温洗脱步骤前标记的抗体）。

3.第二个指标染色

同第一个指标进行相关操作，荧光分子更换为[Cyclic-550]，将[Cyclic-550]以[TSA Diluent稀释液]为1:250-1:500的比例稀释，显色时间为 5-10分钟。

4.第三个指标染色

同第一个指标进行相关操作，荧光分子更换为[Cyclic-630]，将[Cyclic-630]：[TSA Diluent稀释液]为1:100-1:250的比例稀释，显色时间为10-15分钟。

5.核染色

将[DAPI]：PBS 溶液为 1:49 的比例稀释。

依次将切片正面朝上平铺于保湿盒内，滴加适量稀释后的[DAPI]完全均匀覆盖组织，常温避光孵育 5分钟。

将切片放入放置 PBS 溶液的染色缸，依次更换 PBS 溶液，洗涤 3 次，每次 2分钟。

荧光显微镜下观察是否有特异着色，确定特异着色后再进行封片。

6.封片

用胶头滴管吸取[Mounting Medium]，滴加一滴[Mounting Medium]完全均匀覆盖组织，用镊子夹取规格适合的干净盖玻片，轻轻覆盖组织，避免产生气泡。

7.显微成像

将切片置于荧光显微镜/共聚焦/多通道荧光扫描仪/多光谱成像系统下观察并采集图像。

成像波长设置请参考下表。

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