酶联免疫吸附实验（ELISA）操作流程

ELISA实验开始前，各试剂均应平衡至室温。试剂或样品稀释时，确保混匀，同时尽量避免起泡。

1. 抗体包被：根据实验需要用碳酸盐缓冲液（CBS）或者磷酸盐缓冲液（PBS）将包被抗体稀释到一定的稀释度，100 μL/孔包被，37℃ 2 h或者4℃过夜。

2. 洗板：弃孔内液体，甩干，1xTBST洗板2次，每次浸泡1-2 分钟，350 μL/孔，甩干（也可以轻拍将孔内液体拍干）。

3. 封闭：每孔加入200 ~350 μL封闭液，37℃，1 h。

4. 洗板：同步骤2。

注：商品化试剂盒一般已经预包被了包被抗体在酶标板上，不需要进行1-4步骤，使用前请注意核实。

5. 加样：分别设零孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100 μL，余孔分别加标准品或待测样品100 μL。酶标板加上盖或覆膜，37℃反应60-120 分钟。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。

注：加样过程中不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，一块板要在10 分钟内上完样品

6. 洗板：弃孔内液体，甩干，1xTBST洗板4次，每次浸泡1-2 分钟，350 μL/孔，甩干（也可以轻拍将孔内液体拍干）。

7. 加检测抗体：根据实验需要，将检测抗体用1xPBS稀释到一定的稀释度，100 μL/孔，37℃，45 分钟。

8. 洗板：同步骤6。

9. 加二抗：根据实验需要，将二抗用1xPBS稀释到一定的稀释度，100 μL/孔，37℃，30 分钟。

10. 洗板：同步骤6。

11. 显色：TMB显色液A液和B液按1:1充分混合，100 μL/孔，37℃孵育10 分钟。

12. 终止：1M硫酸溶液100 μL/孔，终止显色。

13. 酶标仪读值：以630 nm为校正波长，用酶标仪在450 nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值），在加终止液后5 分钟内进行读数。

14. 结果判断：

1） 每个标准品和样本的OD值须减去零孔的OD值，如设置复孔，则应取其平均值；

2） 以标准品的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，使用专业制作曲线软件进行四参数拟合（4-PL），如Origin、ELISACalc等，根据样品的OD值由标准曲线推算出相应的拟合浓度，再乘以稀释倍数即为样本的测定浓度。

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