IF-cell细胞免疫荧光操作视频

细胞免疫荧光（IF-cell）操作流程

1.相关试剂配方

2.细胞固定

1）贴壁细胞形态正常且细胞密度达到50%～70%左右，悬浮细胞一般1×10⁶的密度，移除细胞培养液。

2）1×PBS室温清洗1次。

3）移除1×PBS，加入固定液4% PFA，室温固定15 分钟。或者加入冰甲醇，固定3~5 分钟。

4）1×PBS室温清洗3次，每次5 分钟。

3.通透和封闭

在固定步骤中使用了甲醇等有机溶剂固定液时，无需进行通透这个步骤，注意过度通透会破坏细胞结构并导致信号丢失，需严格把控浓度和时间。

1）加入通透液，室温孵育15分钟。

2）移除通透液，加入1×PBST，室温清洗2次，每次5分钟。

3）加入足量封闭液，室温孵育1h。

4.抗体孵育

1）根据说明书用抗体稀释液稀释一抗。

2）移除封闭液，加入稀释好的一抗覆盖细胞，2~8℃孵育过夜。

3）移除一抗，加入1×PBST，放置水平摇床上，室温清洗3次，每次5分钟。

4）移除PBST，加入荧光二抗，室温避光孵育45分钟。

5）移除二抗，加入1×PBST，放置水平摇床上，室温清洗3次，每次5分钟。

6）用含DAPI的抗荧光淬灭剂封片，避光保存。

组织免疫荧光（IF-tissue）操作流程

注意：整个操作过程应保持切片处在湿润环境中（湿盒），避免切片变干，否则极易产生非特异染色。

1.石蜡切片脱蜡至水

在对石蜡切片染色前，须进行脱蜡处理，才能使切片顺利染色。

2.程序

1）二甲苯Ⅰ 10分钟；

2）二甲苯Ⅱ 10分钟；

3）二甲苯Ⅲ 10分钟；

4）无水乙醇Ⅰ 3分钟；

5）无水乙醇Ⅱ 3分钟；

6）95%酒精 3分钟；

7）流水冲洗 3分钟。

3.石蜡切片抗原修复

修复方式可根据抗原进行调整，修复后进行透膜与封闭。

1）水煮修复：高温容器中加入适量 1×Tris-EDTA（pH9.0）/ 柠檬酸（PH6.0）缓冲液，电磁炉加热使其沸腾3-5分钟确保低火下无气泡；将组织切片放入容器内，电磁炉调至低功率维持温度在90-95℃煮20分钟，盖上锅盖。室温冷却10分钟后，流水冲洗冷却至室温。（对于骨等容易脱片的组织，可采用60℃过夜修复。）

2）高压修复：高压锅中加入适量1×柠檬酸（pH6.0）缓冲液，不加盖加热至沸腾，将组织切片放入高压锅内，加阀、加热至均匀喷气后，维持2分钟，室温冷却10分钟后，待压力阀落下打开高压锅盖，流水冲洗冷却至室温。

*本方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。

3）微波修复：透明烧杯中加入适量 1×Tris-EDTA（PH9.0）缓冲液，放入微波炉，大火加热至沸腾；将组织切片置于其中，将微波炉调至小火维持温度95-100℃ 20分钟（中间需检查溶液是否没过切片以及切片上是否有气泡）。室温冷却10分钟后，流水冲洗冷却至室温。

*抗原修复的原因：在甲醛或多聚甲醛固定过程中，组织中部分抗原发生了蛋白之间交联及醛基的封闭作用，从而失去抗原活性。通过抗原修复，可以使得细胞内抗原决定簇重新暴露，提高抗原检测成功率。

4. 透膜与封闭

切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈，在圈内滴加封闭液（1×TBST配制的10%山羊血清+ 0.3M甘氨酸+0.25%的Triton X-100），置于湿盒内室温透膜封闭30分钟。

5. 一抗孵育

吸去封闭液，在圈内滴加用1×TBST稀释好的一抗（通常100 μL/组）。切片平放于湿盒内4℃孵育过夜（从4℃冰箱拿出后室温放置30分钟后再进行后继实验操作）。

*使用直标一抗检测时，此步骤结束后即可进行封片。

6.二抗孵育

玻片用1×TBST浸洗3次，每次3分钟。切片拍干后在圈内滴加100 μL预先用1×TBST稀释好的荧光标记羊抗小鼠/兔IgG（含 DAPI 1:10000或Hoechst 33258）覆盖组织，室温孵育1-2 h。

7. 封片

玻片用1×TBST浸洗3次，每次3分钟。清洗完毕后用抗荧光淬灭封片剂封片（封片时组织上不要有气泡，避免影响拍照）。

冰冻切片IHC-Fr实验操作流程

1. 组织固定

灌注固定：通过心脏灌流，首先快速注入预冷的生理盐水或PBS冲洗血液，随后灌注足量预冷的4%多聚甲醛（PFA）固定液。

取材与浸泡固定：迅速剖取目标组织，将其浸泡在10-20倍体积的4% PFA中。

固定条件：置于4℃冰箱内，过夜固定（18小时）。

2.蔗糖脱水

修整组织：固定后，在PBS中简要修剪组织至合适大小和形状。

梯度脱水：首先将组织转移至至少10倍体积的15%蔗糖溶液（1×PBS配制）中，4℃脱水直至组织沉底（约8小时或过夜）。随后转入至少10倍体积的30%蔗糖溶液（1×PBS配制）中，4℃继续脱水直至组织沉底（约1～2天）。

3.OCT包埋

制作模具：使用2-3层铝箔纸折叠成适当大小的方形模具，确保无缝隙漏液。对于有方向要求的组织（如脑），务必在模具上清晰A （Anterior，前）、P (Posterior，后)及样品编号。

组织处理：从蔗糖溶液中取出组织，用洁净滤纸轻轻且彻底地吸干表面液体，确保与OCT接触的各个面完全干燥。

4.切片

系统预平衡：启动冰冻切片机，将箱体温度和样品头温度均设置为-20℃。此温度是经过优化的平衡点，能使富含水的生物组织和OCT达到一个既不会太软（粘刀）也不会太脆（碎裂）的理想硬度。使用时亦可根据实际情况，调整至-15℃～-25℃。

部件预冷：安装新的或锋利的刀片，并安装好防卷板。让其与箱体温度充分平衡，防止因部件与环境的温差导致切片粘连或异常卷曲。

组织块固定与复温：在样品托上滴加少量OCT作为“粘合剂”。 将从模具中取出的冻结组织块迅速粘在样品托上，并置于切片机速冻台使其牢固固定。

修块与切片：调整刀架，使刀片刃口与组织块切面保持约1mm的距离。 设置切片厚度为20～50 μm，快速转动粗修手轮，直至修出最大且完整的组织切面。将厚度调整至目标厚度（如10 μm），进行正式切片。转动手轮应保持平稳、匀速。

贴片与储存：使用粘附载玻片平稳轻压切出的组织切片，使其平整地吸附到载玻片上。 立即在载玻片上标注清晰、唯一的样品信息。 -20℃可短期（约1个月）保存；置于-80℃可长期（至少1年）保存抗原活性。

5.切片复温

将冰冻切片从-80℃冰箱取出，置于室温平放，复温30分钟。

6.抗原修复

对于多数免疫荧光实验（尤其是快速冷冻切片或短时间多聚甲醛固定的样本），通常无需抗原修复。若抗原表位被严重掩蔽，应根据一抗说明书或相关文献选择合适的修复方法。若不修复，可直接进入透膜与封闭步骤。

7.透膜与封闭

画疏水圈：用免疫组化专用油性笔在组织周围画圈，圈边与组织边缘的距离保持约0.5 cm，以便限定液体范围并防止样品干涸。

配制封闭液（50 mL 配方）：45 mL 1×TBS或1×TBST 5 mL 与二抗同源的正常血清 1.125 g 甘氨酸（约 0.3 M） 50–500 μL Triton X-100（终浓度 0.1–1%，视抗原定位而定，核定位靶点浓度可偏高） 充分混匀备用。

封闭孵育：将封闭液滴加于疏水圈内，确保完全覆盖组织。 将切片水平放入湿盒中，于室温孵育 30 分钟。

8.一抗孵育

1）轻轻甩掉或用移液器吸去封闭液（不需洗涤）。

2）滴加适量（约100 μL）已按说明书稀释好的一抗工作液，确保液体均匀覆盖组织。

3）将切片置于湿盒中，4℃ 孵育过夜（12–16 h）。

4）次日取出湿盒，于室温复温30 分钟。

5）用1×TBST 缓冲液洗涤3次，每次3 分钟。

9. 荧光标记二抗孵育

1）拍干切片上的清洗液，保持组织表面湿润但不积液。

2）滴加适量（约 100 μL）按推荐稀释的荧光标记二抗工作液。

3）将切片置于避光湿盒中，于室温孵育 1–2 h。

4）用1×TBST 缓冲液洗涤3次，每次3 分钟。

10. DAPI染核/封片

1）完成最后一次清洗后，轻轻吸去多余液体，避免组织完全干燥。应在1–2 分钟内完成封片操作。

2）在组织上滴加一滴含DAPI的抗荧光淬灭封片剂。若样本已提前完成DAPI染色，可使用不含DAPI的封片剂。

3）用镊子夹持盖玻片一侧，从一端缓慢覆盖，以避免产生气泡。

4）长时间保存时，使用中性树脂或透明指甲油密封盖玻片边缘，以防封片剂蒸发。

11. 拍照

客观、准确地记录免疫荧光结果，为定量分析提供可靠数据。

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