免疫组织化学冰冻切片（IHC-Fr）

冰冻切片IHC-Fr实验操作流程

1. 组织固定

灌注固定：通过心脏灌流，首先快速注入预冷的生理盐水或PBS冲洗血液，随后灌注足量预冷的4%多聚甲醛（PFA）固定液。

取材与浸泡固定：迅速剖取目标组织，将其浸泡在10-20倍体积的4% PFA中。

固定条件：置于4℃冰箱内，过夜固定（18小时）。

2. 蔗糖脱水

修整组织：固定后，在PBS中简要修剪组织至合适大小和形状。

梯度脱水：首先将组织转移至至少10倍体积的15%蔗糖溶液（1×PBS配制）中，4℃脱水直至组织沉底（约8小时或过夜）。随后转入至少10倍体积的30%蔗糖溶液（1×PBS配制）中，4℃继续脱水直至组织沉底（约1～2天）。

3. OCT包埋

制作模具：使用2-3层铝箔纸折叠成适当大小的方形模具，确保无缝隙漏液。对于有方向要求的组织（如脑），务必在模具上清晰A（Anterior，前）、P（Posterior，后）及样品编号。

组织处理：从蔗糖溶液中取出组织，用洁净滤纸轻轻且彻底地吸干表面液体，确保与OCT接触的各个面完全干燥。

4. 切片

系统预平衡：启动冰冻切片机，将箱体温度和样品头温度均设置为-20℃。此温度是经过优化的平衡点，能使富含水的生物组织和OCT达到一个既不会太软（粘刀）也不会太脆（碎裂）的理想硬度。使用时亦可根据实际情况，调整至-15℃～-25℃。

部件预冷：安装新的或锋利的刀片，并安装好防卷板。让其与箱体温度充分平衡，防止因部件与环境的温差导致切片粘连或异常卷曲。

组织块固定与复温：在样品托上滴加少量OCT作为"粘合剂"。将从模具中取出的冻结组织块迅速粘在样品托上，并置于切片机速冻台使其牢固固定。

修块与切片：调整刀架，使刀片刃口与组织块切面保持约1mm的距离。设置切片厚度为20～50 μm，快速转动粗修手轮，直至修出最大且完整的组织切面。将厚度调整至目标厚度（如10 μm），进行正式切片。转动手轮应保持平稳、匀速。

贴片与储存：使用粘附载玻片平稳轻压切出的组织切片，使其平整地吸附到载玻片上。立即在载玻片上标注清晰、唯一的样品信息。-20℃可短期（约1个月）保存；置于-80℃可长期（至少1年）保存抗原活性。

5. 切片复温

将冰冻切片从-80℃冰箱取出，置于室温平放，复温30分钟。

6. 抗原修复

对于多数免疫荧光实验（尤其是快速冷冻切片或短时间多聚甲醛固定的样本），通常无需抗原修复。若抗原表位被严重掩蔽，应根据一抗说明书或相关文献选择合适的修复方法。若不修复，可直接进入透膜与封闭步骤。

7. 透膜与封闭

画疏水圈：用免疫组化专用油性笔在组织周围画圈，圈边与组织边缘的距离保持约0.5 cm，以便限定液体范围并防止样品干涸。

配制封闭液（50 mL 配方）：45 mL 1×TBS或1×TBST、5 mL 与二抗同源的正常血清、1.125 g 甘氨酸（约 0.3 M）、50–500 μL Triton X-100（终浓度 0.1–1%，视抗原定位而定，核定位靶点浓度可偏高），充分混匀备用。

封闭孵育：将封闭液滴加于疏水圈内，确保完全覆盖组织。将切片水平放入湿盒中，于室温孵育 30 分钟。

8. 一抗孵育

1）轻轻甩掉或用移液器吸去封闭液（不需洗涤）。

2）滴加适量（约100 μL）已按说明书稀释好的一抗工作液，确保液体均匀覆盖组织。

3）将切片置于湿盒中，4℃孵育过夜（12–16 h）。

4）次日取出湿盒，于室温复温30分钟。

5）用1×TBST缓冲液洗涤3次，每次3分钟。

9. 荧光标记二抗孵育

1）拍干切片上的清洗液，保持组织表面湿润但不积液。

2）滴加适量（约100 μL）按推荐稀释的荧光标记二抗工作液。

3）将切片置于避光湿盒中，于室温孵育 1–2 h。

4）用1×TBST缓冲液洗涤3次，每次3分钟。

10. DAPI染核/封片

1）完成最后一次清洗后，轻轻吸去多余液体，避免组织完全干燥。应在1–2分钟内完成封片操作。

2）在组织上滴加一滴含DAPI的抗荧光淬灭封片剂。若样本已提前完成DAPI染色，可使用不含DAPI的封片剂。

3）用镊子夹持盖玻片一侧，从一端缓慢覆盖，以避免产生气泡。

4）长时间保存时，使用中性树脂或透明指甲油密封盖玻片边缘，以防封片剂蒸发。

11. 拍照

客观、准确地记录免疫荧光结果，为定量分析提供可靠数据。