青科沙龙第173期 | Cell-时间分辨荧光蛋白在时间和光谱维度拓展显微成像技术

荧光显微镜技术是生命科学研究的核心工具，已广泛应用于细胞结构与动态过程解析。当前主流成像模式为稳态荧光成像，主要依赖荧光强度信号；而时间分辨荧光成像则通过追踪荧光发射随时间衰减的动力学过程，获取荧光寿命信息，为细胞观测提供了全新的维度。近年来，荧光蛋白衍生物家族不断扩展，其光谱性能持续优化，为稳态成像提供了丰富的标记工具。然而，针对荧光寿命参数的系统性调控研究仍相对薄弱，相关分子机制与理性设计策略尚不完善。

多重成像是细胞生物学的重要前沿方向，能够在同一活细胞中同步可视化多个生物靶点，从而系统解析其生成、转运、互作关系及功能网络。然而，现有荧光蛋白的发射光谱在可见光区重叠严重，导致传统稳态成像方法通常难以区分超过六种蛋白。荧光寿命成像显微镜（FLIM）为该瓶颈提供了潜在突破路径，但基于荧光蛋白的寿命多重成像体系发展仍显滞后。如何实现对荧光蛋白寿命的有效调控，发展寿命差异显著的新型荧光蛋白标签，并在此基础上构建高信噪比、高分辨率的寿命多重成像新范式，已成为领域内亟待攻克的关键挑战。

2025年9月22日，西湖大学理学院化学系张鑫团队在《Cell》上在线发表题为“Time-resolved fluorescent proteins expand fluorescent microscopy in temporal and spectral domains”的研究论文。该研究成功开发了一类新型时间分辨荧光蛋白（tr-FPs），其发射光谱覆盖整个可见光区（383–627 nm），荧光寿命可在1–5纳秒范围内灵活调控。基于此技术突破，研究团队在活细胞中实现了9种蛋白质的同时动态成像，并将传统的Fucci细胞周期探针升级为仅需单一荧光通道的时间分辨版本（tr-Fucci）。此外，该技术还被拓展至多重超分辨荧光寿命成像领域，首次实现了四种细胞器与细胞骨架蛋白的超分辨动态可视化，为活细胞蛋白质化学计量分析提供了全新工具。这项研究为荧光蛋白的理性设计与复杂活细胞成像应用，提供了一个功能强大的创新平台。

研究介绍

在研究策略上，团队选取mTurquoise2、mNeonGreen和mScarlet等高亮度荧光蛋白为模板，对其发色团周围关键氨基酸进行系统饱和突变，筛选出一系列光谱稳定且寿命差异显著的tr-FP变体。实验表明，荧光寿命差异主要由发色团邻近残基的定点突变所决定，而受亚细胞定位影响较小。结构与理论分析进一步揭示，位于发色团电子供体基团3.5 Å范围内的氨基酸对寿命缩短贡献最大，2–5 Å范围内的残基则发挥次要调控作用。结合QM/MM模拟、分子动力学与飞秒瞬态吸收实验，团队证实短寿命变体倾向于激发态扭转构象以增强非辐射衰减，而长寿命变体则维持平面构型以延长发射过程。该策略被成功推广至EBFP2、mVenus、mOrange、mKate2等多种母体蛋白，最终构建出包含28种变体的“彩虹”tr-FP工具库，覆盖全可见光谱。

在功能应用层面，tr-FP展现出卓越的多重成像能力。研究人员将不同寿命的mTurquoise2衍生tr-FPs分别标记线粒体、溶酶体与微管蛋白，在HeLa细胞中实现单一光谱通道下的亚细胞结构区分与动态追踪，成功捕捉到溶酶体典型的“走走停停”迁移行为。进一步通过三光谱通道标记六种细胞器并进行三维成像，清晰揭示了细胞内高度复杂的结构网络。尤为突破的是，团队实现了九种蛋白质在同一活细胞中的同时可视化，即使在高密度标记条件下仍能依据寿命特征实现精准区分。

在生物学机制探索中，tr-FP被用于研究铁死亡与氧化应激条件下细胞器的动态响应，揭示了两类应激过程的共性与差异特征，深化了对细胞死亡机制的理解。在细胞周期研究中，团队开发了时间分辨版本的tr-Fucci系统，实现了单通道高精度细胞周期监测，捕捉到CDK4/6抑制剂诱导的非典型周期回退现象，并同步解析了细胞器在分裂过程中的分离与再分配规律。

在超分辨成像方面，研究团队对高亮度荧光蛋白oxStayGold进行寿命工程化改造，筛选出多种寿命差异变体，并成功应用于STED-FLIM成像，显著提升了空间分辨率与多重区分能力。

此外，团队还建立了基于荧光寿命的蛋白质定量方法，将寿命信号与化学计量比关联，准确测定核孔复合体NUP96与NUP107的比值为1.1，并系统比较了多种IRES与2A肽在哺乳动物细胞中的表达效率，为合成生物学研究提供了可靠参考。

综上所述，本研究提出了系统的荧光寿命调控新策略，构建了覆盖全光谱的tr-FP工具库，并成功拓展至多重动态成像、超分辨成像与定量分析等多个前沿方向，显著提升了荧光显微镜在复杂生命体系研究中的解析能力。该系列成果为细胞生物学、神经科学及疾病研究提供了强有力的成像工具，有望在未来成为生命科学研究与转化应用中的重要标准平台。

文章研究机制图