Anti-DYKDDDDK (Flag) Affinity Resin

功能

产品包装:

产品描述:

Anti-DYKDDDDK亲和凝胶来源于Anti-DYKDDDDK[A2-A4]重组鼠单克隆抗体,与直径为45-165μm的琼脂糖凝胶共价偶联。 [A2-A4]可特异性地结合哺乳动物和细菌提取物中的甲硫氨酸修饰的N端Flag融合蛋白、C端Flag融合蛋白。

Anti-DYKDDDDK亲和凝胶可用于常用的免疫沉淀程序检测和捕获Flag标记的融合蛋白。可以通过离心或层析柱实现快速高效的分离,以促进实验过程。

产品性能:

产品形式:Anti-DYKDDDDK亲和凝胶保存在PBS,pH7.4添加防腐剂的缓冲液中,以50%的悬浮液形式提供。包装体积为总体积,每毫升本产品中共含有0.5ml纯凝胶(沉淀物)。

结合能力:每1mL纯凝胶可结合0.8mg 融合蛋白,测试蛋白C端融合Flag标签,分子量为70KDa的蛋白。

保存条件:

Anti-DYKDDDDK亲和凝胶采用蓝冰运输。建议在2-8℃下储存,可稳定保存2年。请勿-20℃保存。

注意事项和免责声明:

本产品仅限于科学研究使用,不得用于临床诊断或治疗。

使用说明:

一、样品制备

1. 建议将蛋白裂解液控制在pH6-8,NaCl或KCl浓度≥0.15M可获得较好的实验效果。

2. 蛋白裂解液需要离心(10000×g,15min)才能去除干扰蛋白质结合的细胞碎片和微粒。如想获得更好的实验效果,蛋白裂解液还可通过0.45 µm或0.22 µm滤器过滤。

二、免疫沉淀((Immunoprecipitation, IP)

对于IP反应,建议每个反应(1x10^6细胞 或500μL裂解液)使用20-30µL的亲和凝胶悬浮液。

1.轻轻重悬凝胶,取出适当的体积到合适的离心管中。6000×g 离心30 秒以收集亲和凝胶,弃上清。

2.用10倍凝胶悬浮液体积的TBST清洗亲和凝胶,6000×g 离心30 秒,弃上清,重复该步骤三次。

3.将500µL处理好的细胞裂解液添加到洗涤过的亲和凝胶中。(可根据样品中目的蛋白丰度来调整裂解液的体积)。对于阳性对照,将500uL TBST 和4 µL 50 ng/µL Flag融合蛋白(~200ng)添加到洗涤过的亲和凝胶中。对于阴性对照,仅添加500uL的裂解缓冲液,不含蛋白质。

4.轻轻摇动(推荐使用旋转混匀仪)所有样品和对照1小时。为了提高结合效率,可将结合步骤延长至4℃过夜反应。

5.将离心管6000×g 离心30 秒以收集亲和凝胶。用移液器吸头(推荐使用细长的吸头或者1mL吸头上套200µL吸头来使用)去除上清液(注意防止吸头沾到亲和凝胶)

6.用10倍凝胶悬浮液体积的 TBST清洗亲和凝胶三次。

三、洗脱:

本产品根据不同的下游应用要求等,可使用多种洗脱方法,包括Flag多肽、酸性和SDS-PAGE上样缓冲液等洗脱液进行洗脱。

1、酸性洗脱法:本方法为非变性法,比较快速且高效。洗脱后的蛋白保持原有的生物活性,便于后续分析检测。

每10uL原始凝胶悬浮液,加入100ul酸性洗脱液(0.1M 甘氨酸,0.2M 精氨酸,pH2.7),混匀后置于旋转混合仪上,室温孵育5分钟。孵育完毕后,将离心管6000×g 离心30 秒,将上清转移到新的离心管中,并立刻加入10uL中和液(1M Tris-HCl, pH9.0),混匀。为了获得最大的洗脱效率,可重复上述步骤,并将相同样品合并。

洗脱并中和的目的蛋白置于4℃待用,或者-20℃或-80℃长期保存。

注:1)酸性洗脱法虽然高效,但仍可能低于SDS-PAGE上样缓冲液洗脱法。

2)由于目的蛋白的差异可能对酸性洗脱法的洗脱效率有一定的影响,如果对洗脱效率的要求比较高,可对酸性洗脱液的pH在2.5-3.1之间进行一定的调整,相应的中和液的pH值或量也要进行一定的调整。

2、 SDS-PAGE上样缓冲液洗脱法:本方法为变性法,得到的蛋白样品适合SDS-PAGE电泳或Western Blot检测。每20μL原始凝胶悬液体积,加入20μL 2X SDS-PAGE上样缓冲液,95ºC加热5分钟。6000×g在4ºC或室温离心30秒,取上清进行SDS-PAGE电泳或WB检测。

注:由于上样缓冲液中SDS会破坏Flag抗体,所以洗脱后的凝胶不能重复使用。

3、 3X Flag竞争洗脱法:本方法为非变性法,洗脱效率高,且洗脱后的蛋白保持原有的生物活性,便于后续分析检测。

3X Flag多肽洗脱液的配制:取适量3X Flag多肽溶解于1XTBS+1%Triton+0.1%SDS中,使其终浓度为300μg/mL。

每10ul原始凝胶体积,加入100ul 3X Flag多肽洗脱液(300μg/ml),混匀后置于旋转混合仪上,室温摇晃孵育30-60分钟,或4ºC孵育1-2小时。为了提高洗脱效率,可延长孵育时间或重复洗脱。

孵育完毕后,将离心管6000×g 离心30 秒,将上清转移到新的离心管中。上清即为洗脱的Flag标签蛋白。

洗脱的Flag标签蛋白置于4ºC待用,或者-20ºC或-80ºC长期保存。

注:结合的 Flag融合蛋白作为 SDS-PAGE 样品的洗脱会导致 Anti-DYKDDDDK凝胶损坏。凝胶不能再次使用,因为样品缓冲液中的 SDS 会使抗体变性。煮沸还会破坏凝胶结构。

四、结果展示

Immunoprecipitation

Anti-DYKDDDDK [A2-A4] Affinity Gel: Purification of Two Different FLAG-tagged fusion protein from HeLa transfected with Flag-fusion protein expression vector. 10ul Anti-FLAG [A2-A4] Affinity Gel was used for IP per lane.

Lane 1’ Input: Hela transfected with fusion protein vector containing an C-terminal Flag tag, whole cell lysate

Lane 2’, 3’ replicates of batch 1; Lane 4’, 5’ replicates of batch 2; Lane 6’, 7’ replicates of batch 3.

Lane 1 Input: Hela transfected with fusion protein vector containing an N-terminal Flag tag, whole cell lysate

Lane 2, 3 replicates of batch 1; Lane 4, 5 replicates of batch 2; Lane 6, 7 replicates of batch 3.

背景文献

暂无

别名

flag