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Anti-DYKDDDDK (Flag) Affinity Resin

RMB: 2500

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Catalog# HAK21024

Anti-DYKDDDDK (Flag) Affinity Resin

This product has been cited in peer reviewed publications, see list HERE

概述

产品名称

Anti-DYKDDDDK (Flag) Affinity Resin

抗体类型

Affinity Gel

验证应用

IP, Co-IP

产品特性

形态

Liquid

浓度

应用稀释度

靶点

功能

Anti-DYKDDDDK Affinity Resin                                

产品包装:

产品编号

产品名称

产品形式

包装规格(V/V, 1/2)

HAK21024-500 ul

Anti-DYKDDDDK Affinity Resin

50% 凝胶悬液

500 uL

HAK21024-2 mL

Anti-DYKDDDDK Affinity Resin

50% 凝胶悬液

2 mL

HAK21024-10 mL

Anti-DYKDDDDK Affinity Resin

50% 凝胶悬液

10 mL

产品描述:

Anti-DYKDDDDK亲和凝胶来源于Anti-DYKDDDDK[A2-A4]重组鼠单克隆抗体,与直径为45-165μm的琼脂糖凝胶共价偶联。 [A2-A4]可特异性地结合哺乳动物和细菌提取物中的甲硫氨酸修饰的N端Flag融合蛋白、C端Flag融合蛋白。

Anti-DYKDDDDK亲和凝胶可用于常用的免疫沉淀程序检测和捕获 Flag标记的融合蛋白。可以通过离心或层析柱实现快速高效的分离,以促进实验过程。

产品性能:

产品形式:Anti-DYKDDDDK亲和凝胶保存在PBS,pH7.4添加防腐剂的缓冲液中,以50%的悬浮液形式提供。包装体积为总体积,每毫升本产品中共含有0.5ml纯凝胶(沉淀物)。

结合能力:每1mL纯凝胶可结合0.8mg 融合蛋白,测试蛋白C端融合Flag标签,分子量为70KDa的蛋白。

保存条件:

Anti-DYKDDDDK亲和凝胶采用蓝冰运输。建议在2-8℃下储存,可稳定保存2年。请勿-20℃保存。

注意事项和免责声明:

本产品仅限于科学研究使用,不得用于临床诊断或治疗。

使用说明:

一、样品制备

1. 建议将蛋白裂解液控制在pH6-8,NaCl或KCl浓度≥0.15M可获得较好的实验效果。

2. 蛋白裂解液需要离心(10000×g,15分钟)才能去除干扰蛋白质结合的细胞碎片和微粒。如想获得更好的实验效果,蛋白裂解液还可通过0.45 µm或0.22 µm滤器过滤。

二、免疫沉淀((Immunoprecipitation, IP)

对于IP反应,建议每个反应(1x10^6细胞 或500 μL裂解液)使用20-30 µL的亲和凝胶悬浮液。

1.轻轻重悬凝胶,取出适当的体积到合适的离心管中。6000×g 离心30 秒以收集亲和凝胶,弃上清。

2.用10倍凝胶悬浮液体积的TBST清洗亲和凝胶,6000×g 离心30 秒,弃上清,重复该步骤三次。

3.将500 µL处理好的细胞裂解液添加到洗涤过的亲和凝胶中。(可根据样品中目的蛋白丰度来调整裂解液的体积)。对于阳性对照,将500 µL TBST 和4 µL 50 ng/µL Flag融合蛋白(~200 ng)添加到洗涤过的亲和凝胶中。对于阴性对照,仅添加500 µL的裂解缓冲液,不含蛋白质。

4.轻轻摇动(推荐使用旋转混匀仪)所有样品和对照1小时。为了提高结合效率,可将结合步骤延长至4℃过夜反应。

5.将离心管6000×g 离心30 秒以收集亲和凝胶。用移液器吸头(推荐使用细长的吸头或者1mL吸头上套200 µL吸头来使用)去除上清液(注意防止吸头沾到亲和凝胶)

6.用10倍凝胶悬浮液体积的 TBST清洗亲和凝胶三次。

三、洗脱

本产品根据目标蛋白的性质以及后续应用需求,推荐采用下列五种不同的洗脱方法。为了获得最佳效果,可以联合使用多种洗脱方法。洗脱步骤通常均可在室温下进行;但根据特殊实验需求,也可能需要在较低温度下操作。在最后一次清洗步骤完成后,应立即向层析柱中加入洗脱缓冲液。

目的

缓冲液

配方

平衡、清洗

TBS缓冲液(或PBS)

50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.4

蛋白洗脱

碱性洗脱pH 12.0

100 mM Tris, 0.5 M NaCl, pH 12.0

酸性洗脱

100 mM glycine HCl, pH 3.5

中性洗脱

3-4 M NaCl in ddH2O

竞争洗脱

100-500 μg/mL DYKDDDDK peptide in TBS

SDS-PAGE上样缓冲液洗脱法

2X SDS-PAGE sample buffer

再生

再生缓冲液1

100 mM Tris-HCl, 0.5 M NaCl, pH 8.0

再生缓冲液2

100 mM sodium acetate, 0.5 M NaCl, pH 4.0

 

1、碱性洗脱法:向层析柱中加入3-6 Bed Volume (BV)的碱性洗脱缓冲液,收集流穿液,收集管中提前加入1/20 BV的1 M HCl进行中和;洗脱后立即加入清洗缓冲液平衡层析柱。

注:凝胶不要置于碱性洗脱液中超过15分钟。

2、酸性洗脱法:向层析柱中加入3-6 BV的酸性洗脱缓冲液,收集流穿液,收集管中提前加入1/20 BV的1 M Tris(pH 9.0)进行中和;洗脱后立即加入清洗缓冲液平衡层析柱。

注:凝胶不要置于酸洗洗脱液中超过15分钟。

3、中性洗脱法:向层析柱中连续加入5次1 BV的中性洗脱缓冲液,收集流穿液;洗脱后立即加入清洗缓冲液平衡层析柱。若蛋白不能完全洗脱下来,可以将NaCl的浓度提升至4 M。

4、竞争洗脱法:向层析柱中加入2-3 BV 100-500 μg/mL DYKDDDDK(Flag)多肽的竞争洗脱液,通过重力流缓慢流过凝胶,当柱子中剩余约1 BV洗脱液时,封闭柱底,室温孵育30-60分钟;打开柱底收集流穿液。

注:多肽竞争洗脱核心优势是最温和,几乎不破坏蛋白结构,对蛋白活性保护最好,但缺点价格较贵。

5、SDS-PAGE上样缓冲液洗脱法:本方法为变性法,得到的蛋白样品适合SDS-PAGE电泳或Western Blot检测。

适合小规模的实验体系。每20 μL原始凝胶悬液体积,加入20 μL 2X SDS-PAGE上样缓冲液,95ºC加热5分钟。6000×g在4ºC或室温离心30秒,取上清进行SDS-PAGE电泳或WB检测。

注:由于上样缓冲液中SDS会破坏Flag抗体,同时煮沸还会破坏凝胶结构,所以洗脱后的凝胶不能重复使用。

四、再生

Anti-DYKDDDDK亲和凝胶可重复用于纯化相同Flag标签的蛋白,通常无需再生。如果更换了不同的目标蛋白,建议对凝胶进行再生处理。

再生处理的方法:

1、高pH清洗:加入2个Bed Volume (BV)的再生缓冲液1清洗,然后再加入2个BV的TBS(或PBS)缓冲液清洗。

2、低pH清洗:随后加入2个BV的再生缓冲液2清洗。

3、重新平衡:加入3-5个BV的TBS缓冲液清洗。

4、长时间保存,凝胶需保存在含有防腐剂的TBS(或PBS)缓冲液中。

注:也可以使用酸性洗脱液进行再生,但低pH时间长会导致再生次数减少。

五、结果展示

 

Immunoprecipitation

Anti-DYKDDDDK [A2-A4] Affinity Gel: Purification of Two Different FLAG-tagged fusion protein from HeLa transfected with Flag-fusion protein expression vector. 10ul Anti-FLAG [A2-A4] Affinity Gel was used for IP per lane.

Lane 1’ Input: Hela transfected with fusion protein vector containing an C-terminal Flag tag, whole cell lysate

Lane 2’, 3’ replicates of batch 1; Lane 4’, 5’ replicates of batch 2; Lane 6’, 7’ replicates of batch 3.

Lane 1 Input: Hela transfected with fusion protein vector containing an N-terminal Flag tag, whole cell lysate

Lane 2, 3 replicates of batch 1; Lane 4, 5 replicates of batch 2; Lane 6, 7 replicates of batch 3.

 

 

性能指标

Anti-DYKDDDDK (Flag)

Affinity Resin (HAK21024)

免疫沉淀(IP)

√

纯化

√

结合载量

~1.5 mg/mL resin

洗脱

碱性洗脱

√

酸性洗脱

√

中性洗脱

√

多肽竞争洗脱

√

SDS-PAGE上样缓冲液

√

再生

4-10次

 

背景文献

暂无

别名

flag

图片

  • Immunoprecipitation<br /><br />Anti-DYKDDDDK [A2-A4] Affinity Gel: Purification of Two Different FLAG-tagged fusion protein from HeLa transfected with Flag-fusion protein expression vector. 10ul Anti-FLAG [A2-A4] Affinity Gel was used for IP per lane.<br /><br />Lane 1’ Input: Hela transfected with fusion protein vector containing an C-terminal Flag tag, whole cell lysate<br /><br />Lane 2’, 3’ replicates of batch 1; Lane 4’, 5’ replicates of batch 2; Lane 6’, 7’ replicates of batch 3.<br /><br />Lane 1 Input: Hela transfected with fusion protein vector containing an N-terminal Flag tag, whole cell lysate<br /><br />Lane 2, 3 replicates of batch 1; Lane 4, 5 replicates of batch 2; Lane 6, 7 replicates of batch 3.

    Immunoprecipitation

    Anti-DYKDDDDK [A2-A4] Affinity Gel: Purification of Two Different FLAG-tagged fusion protein from HeLa transfected with Flag-fusion protein expression vector. 10ul Anti-FLAG [A2-A4] Affinity Gel was used for IP per lane.

    Lane 1’ Input: Hela transfected with fusion protein vector containing an C-terminal Flag tag, whole cell lysate

    Lane 2’, 3’ replicates of batch 1; Lane 4’, 5’ replicates of batch 2; Lane 6’, 7’ replicates of batch 3.

    Lane 1 Input: Hela transfected with fusion protein vector containing an N-terminal Flag tag, whole cell lysate

    Lane 2, 3 replicates of batch 1; Lane 4, 5 replicates of batch 2; Lane 6, 7 replicates of batch 3.

请注意: All products are "FOR RESEARCH USE ONLY AND ARE NOT INTENDED FOR DIAGNOSTIC OR THERAPEUTIC USE"

引文

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