破骨细胞诱导分化操作步骤

Raw264.7细胞诱导方法

1）24孔板，每孔铺2000-5000个细胞，代次小于P10，培养基为DMEM+10% FBS（Corning， 35-081-CV）。

2）细胞贴壁后，更换含有50ng/mL mouse RANK L的完全培养基。

3）隔天换液，诱导5-7天观察，并采用TRACP 抗酒石酸酸性磷酸酶定量方法或TRAP染色试剂盒（Solarbio，G1492）验证破骨细胞诱导效果。

骨髓细胞诱导方法

1） BALB/C小鼠，6-8周龄，剪下后腿，去除肌肉，分别将大腿骨和小腿骨的两端剪掉，用2ml的注射器吸取提前预冷的PBS，对着一端冲洗出，收集至15ml离心管。

2）过40um的细胞滤网，300g离心5min。

3）用200ul 预冷的PBS重悬细胞，加入1ml红细胞裂解液（Solarbio，R1010），轻轻吹打，裂解5min。本步骤在37℃或4℃操作均可。

4）加入20ml PBS清洗一次。

5）重复步骤4。

6） 300g离心5分钟（4℃离心效果更佳），弃上清，加入1ml完全培养基（1640+20%FBS+1%HEPES+1%双抗）重悬，计数后接种至6孔板中，每孔补充培养至2ml，同时在培养基中加入40ng/ml的M-CSF(巨噬细胞集落刺激因子)，过夜培养。

7）第二天可观察到有大量未贴壁的悬浮细胞，计数，在24孔板中每个孔铺约10000个细胞，同时在培养基中加入40ng/ml的M-CSF和50ng/ml的rankl进行破骨细胞诱导。

8）隔天换液，诱导5-7天观察，并采用TRACP 抗酒石酸酸性磷酸酶定量方法或TRAP染色试剂盒（Solarbio，G1492）验证破骨细胞诱导效果。