破骨细胞诱导分化操作步骤
破骨细胞来源
破骨细胞是由骨髓中的髓系祖细胞(HSC)分化而成的单核巨噬细胞(Macrophage)相互融合，所形成的多核巨细胞(Osteoclast),直径100μm，含有2~50个紧密堆积的核。早期未成熟的增殖性单核吞噬细胞被称为破骨细胞前体，在各种化学因子、转录因子、细胞因子等信号因子的刺激下融合为多核细胞并最终活化为破骨细胞。两个最主要的因子：M-CSF 和RANKL。
目前，破骨细胞的培养方法主要有：骨髓机械分离法，骨髓细胞诱导法，脾干细胞诱导法，血液单核细胞诱导法，小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW264.7诱导法及骨巨细胞瘤分离法。
Raw264.7细胞诱导方法
1）24孔板，每孔铺2000-5000个细胞，代次小于P10，培养基为DMEM+灭活10% FBS（Corning， 35-081-CV）。
2）细胞贴壁后，更换含有50ng/mL mouse RANK L的完全培养基。
3）隔天换液，诱导5-7天观察，并采用TRACP 抗酒石酸酸性磷酸酶定量方法或TRAP染色试剂盒（Solarbio，G1492）验证破骨细胞诱导效果。
骨髓细胞诱导方法
1） BALB/C小鼠，6-8周龄，剪下后腿，去除肌肉，分别将大腿骨和小腿骨的两端剪掉，用2ml的注射器吸取提前预冷的PBS，对着一端冲洗出，收集至15ml离心管。
2） 过40um的细胞滤网，300g离心5min。
3） 用200ul 预冷的PBS重悬细胞，加入1ml红细胞裂解液（Solarbio，R1010），轻轻吹打，裂解5min。本步骤在37℃或4℃操作均可。
4） 加入20ml PBS清洗一次。
5） 重复步骤4。
6） 300g离心5分钟（4℃离心效果更佳），弃上清，加入1ml完全培养基（1640+灭活10%FBS+1% HEPES+1% GlutaMAX+1%双抗）重悬，计数后，以5000/孔接种至24孔板，每孔0.5ml，同时在培养基中加入40ng/ml的mM-CSF(巨噬细胞集落刺激因子)，过夜培养，以筛选单核细胞。
7） 第二天可观察到有大量未贴壁的悬浮细胞，弃上清，换液40ng/ml的mM-CSF和50ng/ml的mRank L进行破骨细胞诱导。
8） 隔天换液，诱导5-7天观察，并采用TRACP 抗酒石酸酸性磷酸酶定量方法或TRAP染色试剂盒（Solarbio，G1492）验证破骨细胞诱导效果。
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