小鼠（大鼠）灌流固定操作
灌流固定（蠕动泵）
1. 准备蠕动泵
1.1 剪去静脉输液针针头部分尖端，使其略微变钝，以防进针时刺破主动脉壁（图1）。
1.2 将转接头和25#硅胶管连接并固定（此处为灌流管路中最易爆开的位置）。
1.3 设置蠕动泵流速
小鼠为12~15mL/min，大鼠为20mL/min左右。
1.4连接灌流装置和输液针
取100 mL水冲洗管道除去管内残留物，然后取两个烧杯分别盛满 PBS和固定液（冰盒预冷），将灌流管开放的末端置入PBS烧杯。开启蠕动泵，待溶液流动缓慢且稳定后关闭蠕动泵（在通风橱中进行）。
2. 准备动物
2.1 禁食
12h或过夜，不禁水。
2.2 称重
称量动物体重并记录。
2.3 麻醉
保定小鼠（或大鼠，下同），针头在下腹部腹白线的偏左或偏右位置，从下腹部朝头方向平行进针，腹腔注射麻醉剂（图2A）。（进针不需太深以避免刺入脏器，有明显穿透感但无阻碍感即可，进针后应确认回抽无血液、肠液、尿液。）
2.4 将小鼠放回笼内，等待约5分钟，小鼠心跳及呼吸均匀、肌肉松弛、四肢无活动、刺激胡须或脚趾无反应，即视为进入深度麻醉状态。若麻醉过量导致小鼠心脏停跳，应尽快开始灌流，避免凝血导致灌流不畅。
2.5 确认小鼠进入麻醉状态后，将其腹部向上摆放在泡沫板或软木材质的手术台上，四肢用胶带或针头/大头针固定（图2B、C），使其在灌流过程中无法随意移动。
3. 心脏灌流
3.1 用眼科镊拉起胸腔外侧皮毛，用解剖剪剪去皮肤，暴露白色剑突。
3.2 用眼科镊拉起剑突，用解剖剪沿剑突下方横向剪开肌肉层，暴露横膈膜，并沿腹中线剪开腹壁暴露肝脏。
3.3 用眼科剪小心剪开横膈膜，注意不要伤到上方的心脏及肺脏。
3.4 沿胸骨外侧剪开两侧肋骨，翻开胸廓前壁并用止血钳固定 (或将此部分组织完全剪除)，以使心脏完全暴露，可看到颜色较深的右心室以及颜色较浅的左心室（图3）。
3.5 用眼科镊及解剖镊清理心脏周围脂肪组织，暴露升主动脉。
3.6 用眼科镊固定心脏，从左心室紧靠心尖处，以大致平行于心脏左右中线的角度刺入注射针（图4A）。由于针尖已经修钝，进针时会有一定的阻力感；成功穿透心室壁时，会有明确的穿透感。
3.7 继续沿着初始方向进针，若方向准确，将不会感到明显阻力，在针头成功进入主动脉时，可透过主动脉壁观察到针头。即刻用血管夹或止血钳固定针头（图4B-D）。
3.8 用眼科剪在右心房剪开一个小口（图4D白色五角星位置），随即可观察到深红色血液流出。
3.9 打开蠕动泵，流速先慢后快，初始转速可设为小鼠6rpm，大鼠设为12rpm，在更换为固定液之前逐渐增加至小鼠9rpm、大鼠15rpm，并保持至灌流结束。
注：可在灌流时暴露腹腔，调整肝脏及脾脏位置，提升两者及后端脏器的灌流效果。
3.10 小鼠在开始灌流20s后关闭蠕动泵停止PBS灌流，迅速将灌流管末端置入装有固定液的烧杯中。确认管路无气泡引入后开启蠕动泵。大鼠在开始灌流7min后更换为固定液，也可在观察到流出液体变澄清，肝脏完全失血后停机将PBS更换为固定液（图5）。
注：一般成年小鼠PBS的灌流量约为15~20mL，大鼠为100~200mL。固定液的灌流量小鼠为20~30mL，大鼠为200~300mL。25#硅胶管内径0.48cm，每1m长的管路中溶液约为18mL。
3.11 在更换至固定液后小鼠再灌流固定2min，大鼠再灌流10min，体重在350g左右的大鼠可延长1min。在灌流固定液时可观察到肌肉收缩、胸腔上拱、尾巴翘起等现象。
4. 取组织固定
4.1 为防止取脑过程中损伤其他组织，可采用断颈取脑。
4.2 用解剖剪断颈，剪下小鼠头部，其余部位暂用湿纱布覆盖保湿。从颈部正中向鼻尖方向剪开头部上方皮毛，暴露颅骨（图6A-C）。
4.3 用解剖剪切除脑干，用眼科剪剪除颅骨周围肌肉，暴露颅骨底部枕骨。
4.4 将眼科剪单侧刀刃平行于鼠脑底部插入枕骨下方，向外分别剪断两侧颅骨。
4.5 用解剖镊小心摘除覆盖小脑的颅骨。
4.6 将眼科剪的单侧刀刃从颅骨中缝处插入，刀刃一侧朝向颅骨，避免损伤脑组织，
沿中缝剪开大脑上方至嗅球上方颅骨。直于鼠脑顶部插入中缝剪开颅骨，用解剖镊一点点小心剥离颅骨（图6C）。或者从枕骨大孔处朝向同侧眼眶方向，贴着骨头剪到眼眶处，两侧均剪开后便可用镊子小心掀去颅骨（图6D-F）。
4.7 用镊子或其他平面钝头工具从鼠脑底部平行插入到嗅球底部，切断下方神经
束，取出鼠脑。
4.8 分离摘取其他组织。
4.9 将组织放置到盛有固定液的样本瓶中，于4℃固定。固定液的量至少应为组织块总体积的10倍。
5. 肺组织灌流
上述方法正常操作时在体内的灌流通路不经过肺脏，如需获取灌流肺脏组织，可采用下列三种方法：
5.1 加大流速（仅针对小鼠）：将针头保持在左心室，在上述流速的基础上逐步增大至10~12rpm，此时可观察到小鼠肺脏膨胀、由红变白，液体从鼻头流出。
5.2 右心室灌流：将针头保持在右心室稍靠上位置，按小鼠5rpm、大鼠10rpm灌流，注意不要捅破肺动脉。
5.3 小鼠肺充气与血管灌注固定：首先通过气管向肺内充气，使其扩张。针头留置右心室，剪开腹主动脉进行灌流。该方法能更准确地保留肺的解剖结构，但需要呼吸机辅助。
注：采用5.1和5.2灌流肺组织时，可能导致其他组织灌流失败；5.3仅能灌流肺脏。