疑难靶点系列——PD-L1 （肿瘤细胞的免死金牌）
PD-L1简介
PD-L1（程序性死亡配体-1，亦称CD274或B7-H1）属于B7超家族成员。人PD-L1基因位于9号染色体短臂2区4带1亚带（9p24.1）。该区域发生基因扩增是导致肿瘤细胞PD-L1表达上调的重要机制之一。
一、 结构与特征
蛋白结构域：
胞外区：包含一个IgV样结构域和一个IgC样结构域，其中IgV样结构域是与受体PD-1及B7.1（CD80）结合的关键区域。
跨膜区：由单一疏水α螺旋跨膜结构域构成。
胞内区：长度较短（约30个氨基酸），缺乏经典信号基序，但其在调控蛋白稳定性、介导反向信号传导等方面的功能逐渐被揭示。
翻译后修饰：PD-L1为高度糖基化的I型跨膜蛋白，其糖基化修饰对蛋白质的正确折叠、稳定性、膜定位及与受体结合的能力具有重要作用。
表达调控：
PD-L1的表达受到多重机制的精密切控，主要包括以下三个层面：
转录水平：主要由炎症信号通路驱动，其中IFN-γ/JAK/STAT信号通路发挥关键作用。此外，PI3K/AKT、NF-κB 等信号通路也参与调控PD-L1的转录。转录后水平：涉及mRNA的稳定性调节，通过多种RNA结合蛋白及非编码RNA等方式影响PD-L1 mRNA的降解与存续。翻译后水平：主要包括去泛素化以增强蛋白稳定性，以及糖基化修饰，这些修饰直接影响PD-L1的构象、定位及功能活性。
二、 PD-L1的核心生物学功能与病理意义
生理功能：维持外周免疫耐受
在正常生理状态下，PD-L1在抗原呈递细胞、部分上皮细胞及免疫豁免组织（如胎盘、眼）中呈低水平表达。当PD-L1与活化T细胞表面的PD-1结合后，可募集SHP2磷酸酶，进而抑制T细胞受体信号通路及其下游的PI3K/AKT/mTOR通路活性，最终导致：
l T细胞增殖受到抑制
l 细胞因子（如IL-2, IFN-γ, TNF-α）形成减少
l 诱导T细胞凋亡或功能耗竭
这一调控机制对防止自身免疫反应及过度免疫损伤具有关键作用。
病理功能：介导肿瘤免疫逃逸
肿瘤细胞利用免疫检查点机制，通过基因扩增、表观遗传改变、炎症信号诱导等多种途径异常高表达PD-L1。在肿瘤微环境中，PD-L1与肿瘤浸润淋巴细胞表面的PD-1结合，直接抑制细胞毒性T细胞（CTL）和Th1细胞的抗肿瘤功能，从而促进肿瘤的生长与转移。该过程是肿瘤微环境形成免疫抑制状态的核心机制之一。
临床意义与靶向治疗
PD-1/PD-L1信号轴是肿瘤免疫治疗的重要靶点。阻断性单克隆抗体可通过解除PD-L1对T细胞的抑制作用，重建机体的抗肿瘤免疫应答。目前，已有多种PD-1/PD-L1抑制剂广泛应用于临床，涵盖非小细胞肺癌、肝细胞癌、尿路上皮癌等多种实体瘤。
2，实验小窍门
Western Blot主要用于检测细胞或组织裂解液中PD-L1的总蛋白表达水平。
1，样本制备
诱导表达处理：多数细胞系中PD-L1的基础表达水平较低。为获得清晰的检测条带，通常需使用IFN-γ或LPS等刺激剂对细胞进行诱导处理。实验时应设置未经诱导的细胞作为阴性对照。
变性处理：建议将蛋白样品于95–100°C加热5–10分钟，以确保蛋白质充分变性、糖基化修饰结构展开，并促进后续免疫识别位点的暴露。
2，凝胶电泳
推荐使用10-12%的SDS-PAGE凝胶。
由于PD-L1为跨膜蛋白且存在糖基化修饰，其电泳迁移率可能受到影响，实验中应注意根据预染蛋白Marker判断目标条带位置。
3，抗体选择与使用
一抗选择：此步骤为实验成功的关键。
特异性：应选用经Western Blot验证的高特异性抗体。例如，HA721176、HA722184等抗体已在多篇研究中得到广泛验证。
种属反应性：须确认所选抗体适用于实验所用样本的种属来源（如人、小鼠、大鼠等）。
4，结果判读
预期条带位置：PD-L1主要条带通常位于 40–55 kDa 范围内，且在电泳图中常呈现弥散（Smear）状，这是其糖基化修饰的典型特征。
可能出现的条带情况：
除主条带外，还可能在以下位置观察到其他条带：
l 更高分子量区域（如60–70 kDa）：通常为糖基化程度更高的PD-L1形式。
l 更低分子量区域（如33 kDa）：可能对应未糖基化或发生蛋白降解的片段。
内参选择：实验中必须设置内参，常用选项包括 GAPDH（~36 kDa）、β-Actin（~42 kDa）或 Vinculin（~124 kDa）。选择时应注意内参条带分子量须与PD-L1目标条带位置明显区分。
对照设置：
建议设置以下对照以验证抗体特异性及实验体系的可靠性：
l 阴性对照：使用已知不表达PD-L1的细胞系（如某些Jurkat亚系）。
l 阳性对照：使用已知高表达PD-L1的细胞系（如经IFN-γ处理的A549细胞）。
IHC检测PD-L1（免疫组织化学法）
IHC可在组织原位检测PD-L1的蛋白表达及定位（如细胞膜表达），是生物标志物研究中的核心技术。
1，样本固定与处理
固定：采用10%中性缓冲福尔马林进行固定。固定时间应严格控制，建议为6–72小时。固定不足可能导致抗原丢失，固定过度则易引起抗原掩蔽并增加后续抗原修复难度。
切片：石蜡切片厚度通常为4-5 μm。
2，抗原修复
PD-L1 的IHC通常需要强烈的抗原修复。
推荐方法：使用EDTA（pH8.0–9.0）修复液，通过高压锅或微波炉进行热诱导表位修复。具体修复条件（时间、pH值）应根据所用一抗及实验室条件进行优化。
3，检测系统与显色
建议使用高灵敏度HRP聚合物检测系统，以降低非特异性背景。
DAB显色过程中，应在显微镜下控制显色时间，避免过显色（背景过深）或显色不足（信号弱）。
4，对照设置
阳性对照：可使用已知PD-L1表达阳性的组织芯片，其中应包含不同表达水平（阴性、弱阳性、强阳性）的样本；或使用PD-L1过表达细胞系制备的石蜡块。
阴性对照：同一张切片中的正常上皮或浸润免疫细胞可作为内源性阴性对照。
实验阴性对照：用PBS或同型IgG替代一抗进行染色，以排除非特异性结合。
自身对照：观察肿瘤区域与癌旁正常组织的染色差异。
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