免疫组织化学（冰冻切片，IHC-Fr）

一、组织准备

1. 新鲜组织取出后置于4%PFA中固定过夜。

2. 15%蔗糖浸润脱水8h。
3. 30%蔗糖浸润脱水15h。

4. 提前准备好标记的模具，将组织放入其中，加入OCT包埋。

5. 缓慢将组织模具放入液氮中浸润，之后转移至-80℃冰箱保存。

注：为了快速处理临床样本，直接用OCT冷冻包埋组织，然后切片（6-8μm厚度），这样可以节省时间减少因固定带来的切片难度。

二、切片制作

1. 切片前，从超低温冰箱中取出组织样品，在-20°C的温度下均衡约30min，防止切片在封闭时破裂。

2. 将组织切成厚度在5–15µm之间的切片，置于带正电荷的载玻片上。

3. 将切片放置在工作台上风干几min（这样可以增加切片的粘附作用）。

注：切好的切片可以置于-80℃保存，保质期1年。

三、染色

1. 切片从冰箱取出后室温恢复15min后，用1×TBST浸洗3次，每次3 min。
2. 抗原修复：如需修复，可采用下述两种修复方式

2.1 微波修复：透明烧杯中加入适量 1×柠檬酸（PH6.0）缓冲液（根据切片数量调整），放入组织切片后置于微波炉内，大火加热约3min至沸腾即可；室温冷却30min后，自来水流水冲洗冷却至室温。

2.2 1％十二烷基硫酸钠溶液（SDS）修复：用1% SDS溶液覆盖组织切片，室温下修复5min后，用PBS缓冲液冲洗3次，每次3-5min。

3. 透膜与封闭：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈，在圈内滴加封闭液（1xTBST配制的含10%阴性山羊血清，0.3M甘氨酸和0.2%的Triton X-100）覆盖组织，置于湿盒内室温孵育30~60min。

4. 清除封闭液，然后每个切片加入用推荐的抗体稀释剂稀释的一抗（通常100μl/组织），置于湿盒4℃孵育过夜。（从4℃冰箱拿出后室温放置30min后再进行后继实验操作）。

5. 第二天从4℃冰箱拿出湿盒，室温平衡30min。

注：使用直标一抗检测时，此步骤结束后即可进行封片。

6. 用1×TBST浸洗3次，每次3 min。切片拍干后在圈内滴加100μl预先稀释好的荧光标记羊抗小鼠/兔IgG（含DAPI 1:10000或Hoechst 33258）覆盖组织，室温孵育1。

7. 封片：用1×TBST浸洗3次，每次3 min。清洗完毕后用抗荧光淬灭封片剂封片（封片时组织上不要有气泡，避免影响拍照）。

四、注意事项

1. OCT包埋前须完全除去组织表面的液体，防止冷冻时形成冰晶损伤组织。

2. OCT中不能有气泡，特别是样品附近的气泡会影响冰冻切片效果。

3. 冰冻切片-20℃保存时间约为1个月，如需长期保存请置于-80℃，可保存一年。

五、常见问题与解决方案

1. 卷曲：切片刀温度较高/防卷板安装的位置太过靠前/脑组织未速冻完全，可适当向后调节防卷板位置、提前便安装防卷板和刀片预冷。

2. 褶皱：冰冻箱中操作温度过高，应将适当调低箱体温度。

3. 破碎：防卷板上存在缺口或冰冻箱内温度过低，应及时更换防卷板或适当调高箱体温度。