实验干货 | 做了这一步，WB实验成功率至少提高50%？！

蛋白质印迹法（免疫印迹试验）即Western Blot。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。

Western Blot是一项入门实验，但是想要做好并没有那么容易，鉴于其步骤多、流程长的特点，每一个环节都显得尤为重要。俗话说，好的开始是成功的一半，今天我们就来详细讲讲实验开始之前你要做的事——了解你的靶蛋白！靶点蛋白本身的特殊性，会直接或间接影响实验结果。小编将从定位、表达、修饰这几个方面进行介绍，帮助你更了解靶蛋白，做出更完美的WB条带！

靶蛋白定位对WB实验的影响

PART 01 组织定位

确定靶蛋白组织定位，是WB实验中选择合适样本的第一步。

查询网址：https://www.uniprot.org/

这里以查找人源VDAC1蛋白定位为例

根据实际样本来源，选择相应种属（人，小鼠，大鼠等），进而确定靶蛋白的组织表达。

从图中可见，人源的VDAC1在红细胞中表达（蛋白质水平）、在心脏、肝脏和骨骼肌中表达，在骨骼肌，舌头的平滑肌中相对表达较强。那么，在制备样本时，即可根据具体的实验需求，选择适合的材料。

PART 02 亚细胞定位

确定靶蛋白亚细胞定位，是体外实验中选择合适细胞类型及正确裂解方法的关键步骤。

我们同样以人源VDAC1蛋白为例：

根据数据库显示的信息，我们可以知道，人源的VDAC1蛋白在线粒体外膜、细胞膜和膜筏中均有表达，那么聪明的你是不是一下就知道应该选择哪一种裂解液了呢？

当然，还有以下两点需要注意：

1.提取核蛋白时，为获取更多核组分，推荐超声裂解；

2.检测不同亚细胞结构的目的蛋白时，需要检测相应组织中的内参进行进行定性/定量。

PART 03 内参选择
内参即是内部参照（Internal Control），对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白。它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。

内参抗体（Internal Control Antibody）是对内参蛋白进行检测，用以校正蛋白定量过程中的实验误差以及验证转膜、显色等步骤是否正常。

哺乳动物细胞中常用的内参种类很多且分布广泛，包括但不限于：Actin (肌动蛋白),Tubulin (微管蛋白), GAPDH，Lamin B1, HDAC, PCNA等。细胞浆、细胞核、细胞膜内参为三大常用内参。其中，β-actin，GAPDH，β-tubulin为最常用的三大细胞浆内参靶点。

关于内参的选择，HUABIO有出过一期推文进行介绍，点击下方链接获取详细内容：

如何跑出好看的内参条带，有这一篇指南就够了!

靶蛋白表达对WB实验的影响

靶蛋白在样本中的表达差异，同样会影响实验结果。以下是常见靶蛋白表达差异的解决方法：

第一种情况的解决方案很好理解，我们已经在前面的介绍过了，第二种情况的解决方案也很好理解，实践出真知，多次尝试即可。

第三种情况，有的读者可能一头雾水，别急，小编举一个实例，包你豁然开朗！

1. 蛋白需要诱导刺激
每种靶蛋白的情况都不一样，首先还是需要查找文献或Uniprot等数据库数据，确认靶蛋白是否需要诱导刺激才能够检测到信号。部分靶蛋白（例如炎症信号通路相关蛋白），在正常组织细胞样本中不表达，需要进行特殊诱导刺激处理，才能够激活蛋白表达。具体的诱导刺激条件需要大家检索相关文献查找。

我们这里以c-Fos蛋白为例：

c-Fos的本底表达水平比较低，需要进行刺激以在WB实验中进行检测。一般使用血清饥饿，然后进行20% FBS处理2小时或200nM PMA处理4小时的方式可以诱导细胞中c-Fos表达。

注意：刺激后c-Fos的表达迅速且短暂，因此刺激完成后需要立即收样来制备裂解液，以避免蛋白消失。

Western blot analysis of c-Fos on different lysates with Rabbit anti-c-Fos antibody (HA722666) at 1/1,000 dilution.
Lane 1: HeLa cell lysate
Lane 2: HeLa serum starved for 40 hours then add 20% FBS for 2 hours cell lysate
Lane 3: RAW264.7 cell lysate
Lane 4: RAW264.7 serum starved for 16 hours then add 200nM PMA for 4 hours cell lysate
Lane 5: C6 cell lysate
Lane 6: C6 serum starved for 16 hours then add 10% FBS for 30 minutes cell lysate
大家可以看到Lane 1和Lane 2；Lane 3和Lane 4；Lane 5和Lane 6之间的区别，就是诱导条件因素对实验结果产生的影响，是不是很明显呢。

靶蛋白翻译后修饰对WB实验的影响

翻译后修饰（Post-translational modification，PTM）是指蛋白质在翻译后的化学修饰。对于大部分的蛋白质来说，这是蛋白质生物合成的较后步骤，是细胞信号传导中的重要组成部分。常见的几种修饰包括糖基化修饰，磷酸化修饰，泛素化修饰，乙酰化修饰，甲基化修饰等。

糖基化是蛋白质翻译后的主要修饰之一，对蛋白质的折叠、构象、分布、稳定性和活性都有重要影响。蛋白质糖基化类型有三种：N-糖基化，O-糖基化和GPI糖基磷脂酰肌醇锚。以天冬氨酸连接（N-连接）或丝氨酸/苏氨酸连接（O-连接）寡糖形式存在的碳水化合物是许多细胞表面和分泌蛋白的主要结构成分。

磷酸化主要是在丝氨酸（Ser）、苏氨酸（Thr）或酪氨酸（Tyr）残基上加入磷酸根基团，是目前研究得最深入的翻译后修饰之一。磷酸化在细胞周期、生长、凋亡和信号转导等过程中起着重要的调控作用。

泛素化过程通常由泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasomesystem，UPS）介导。当蛋白被泛素标记后，就会通过蛋白酶体途径降解。

若蛋白存在翻译后修饰，可能会引起WB检测时实际条带与预测值不符，主要有以下两种情况：

01 翻译后修饰导致检测条带大小与预测不符
EPCR靶点预测分子量为27kDa左右，但实际检测分子量为45kDa。