Skip to content

免疫沉淀IP

免疫沉淀IP

免疫沉淀(Immunoprecipitation,IP )是利用抗体抗原特性性结合的一种亲和纯化技术,广泛应用于从组织或细胞裂解物中富集、分离天然靶蛋白。

一、样品准备

可选择与您研究材料相匹配的标准操作流程进行细胞或组织的裂解。也可参考华安官网“蛋白质免疫印迹”操作中样本裂解的操作。
1. 高浓度的去垢剂会干扰免疫沉淀效果。所以可先用RIPA裂解细胞或组织,制备蛋白裂解液,在开始免疫沉淀步骤时,再补加1 xTBS或IP孵育液稀释到需要的体积。
2. 使用足量的蛋白裂解物:单管IP实验,推荐裂解物初始蛋白量为1-3 mg
3. 确保裂解液中添加了蛋白酶抑制剂,蛋白酶抑制剂用量可以是正常WB实验制样的1.5-2倍。

二、免疫沉淀

1. 取适量的裂解液加入到EP管(低吸附)中,同时加入1-4μg抗体,用1xTBS或IP 孵育液补齐至1mL体积,最佳抗体量应由抗体效价决定。另取等量裂解液,加入等量1xTBS或IP 孵育液和等量同型IgG作为Control IgG对照组。
2. 将EP管全部置于旋转架上,4℃,旋转2–4h或过夜。
3. 加入20-50μl重悬的 Protein A琼脂糖珠或磁珠 4℃ 旋转孵育1-2h。
4. 4 ℃500g 离心30s,弃上清。或置于磁力架上静置1min。
5. 加入1mL 含蛋白酶抑制剂的1× TBS,洗涤沉淀复合物,4℃,500g 离心30s(或置于磁力架上静置1min),吸弃上清;重复洗涤4-5次。最后一次洗涤/离心结束后,EP管中保留约80 μl溶液(其余都吸弃)。
6. 加20μl 5x SDS-PAGE蛋白上样缓冲液,重悬IP复合物beads,95–100℃ 沸水浴 5min , 然后8,000-10,000g 离心3min, 小心吸取上清转入新的EP管中。

三、WB 分析

1. 将收集的IP样品加入SDS-PAGE对应泳道, 可以将剩余IP样品于-80℃保存备用。 
2. 通过SDS-PAGE分离IP样品,并将蛋白转移至PVDF膜,使用合适抗体进行后续检测。
注:对IP样品进行WB检测时,为了消除或减少样品中的抗体重轻链干扰,可用IP二抗检测,如华安Catalog# NBI01H(兔)和Catalog# NBI02H(鼠)。

 

Close (esc)

Popup

Use this popup to embed a mailing list sign up form. Alternatively use it as a simple call to action with a link to a product or a page.

Age verification

By clicking enter you are verifying that you are old enough to consume alcohol.

搜索