免疫沉淀IP
免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP ）是利用抗体抗原特性性结合的一种亲和纯化技术，广泛应用于从组织或细胞裂解物中富集、分离天然靶蛋白。
一、样品准备
可选择与您研究材料相匹配的标准操作流程进行细胞或组织的裂解。也可参考华安官网“蛋白质免疫印迹”操作中样本裂解的操作。
1. 高浓度的去垢剂会干扰免疫沉淀效果。所以可先用RIPA裂解细胞或组织，制备蛋白裂解液，在开始免疫沉淀步骤时，再补加1 xTBS或IP孵育液稀释到需要的体积。
2. 使用足量的蛋白裂解物：单管IP实验，推荐裂解物初始蛋白量为1-3 mg。
3. 确保裂解液中添加了蛋白酶抑制剂，蛋白酶抑制剂用量可以是正常WB实验制样的1.5-2倍。
二、免疫沉淀
1. 取适量的裂解液加入到EP管（低吸附）中，同时加入1-4μg抗体，用1xTBS或IP 孵育液补齐至1mL体积，最佳抗体量应由抗体效价决定。另取等量裂解液，加入等量1xTBS或IP 孵育液和等量同型IgG作为Control IgG对照组。
2. 将EP管全部置于旋转架上，4℃，旋转2–4h或过夜。
3. 加入20-50μl重悬的 Protein A琼脂糖珠或磁珠 ，4℃ 旋转孵育1-2h。
4. 4 ℃，500g 离心30s，弃上清。或置于磁力架上静置1min。
5. 加入1mL 含蛋白酶抑制剂的1× TBS，洗涤沉淀复合物，4℃，500g 离心30s（或置于磁力架上静置1min），吸弃上清；重复洗涤4-5次。最后一次洗涤/离心结束后，EP管中保留约80 μl溶液（其余都吸弃）。
6. 加20μl 5x SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，重悬IP复合物beads，95–100℃ 沸水浴 5min , 然后8,000-10,000g 离心3min, 小心吸取上清转入新的EP管中。
三、WB 分析
1. 将收集的IP样品加入SDS-PAGE对应泳道， 可以将剩余IP样品于-80℃保存备用。
2. 通过SDS-PAGE分离IP样品，并将蛋白转移至PVDF膜，使用合适抗体进行后续检测。
注：对IP样品进行WB检测时，为了消除或减少样品中的抗体重轻链干扰，可用IP二抗检测，如华安Catalog# NBI01H（兔）和Catalog# NBI02H（鼠）。