蛋白质免疫印迹(WB)
蛋白质免疫印迹(WB)
免疫印迹 (Immunoblotting) 又称蛋白质印迹 (Western blot，WB)，是一种综合性的免疫学检测技术。它利用SDS-PAGE技术将生物样品中的蛋白质分子按分子量的大小在凝胶上分离开，然后用电转移的方法将蛋白转移到固相膜上，以固相膜上的蛋白质作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶标记的第二抗体起反应，经过底物显色或荧光成像等方法以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白质。
一、相关试剂配方：
一、相关试剂配方：
1、裂解缓冲液
这些缓冲液在 4 ℃ 下可保存数周，也可分装后在 -20 ℃ 下保存长达 1 年。使用前添加蛋白酶抑制剂或磷酸酶抑制剂等。根据实际需求选择合适的裂解缓冲液。
2、5x SDS-PAGE蛋白上样缓冲液
3、电泳缓冲液（Tris-Glycine/SDS）
5、转膜缓冲液（湿转）
6、1x TBST（洗涤液）
1x TBST：取250mL 20x TBS，加入5mL Tween 20，加入超纯水定容至5L，混匀后室温保存，有效期1周。
7、封闭缓冲液
7、封闭缓冲液
3–5% 牛奶或 BSA（牛血清白蛋白）
二、样本裂解
二、样本裂解
1、细胞裂解液的制备
1) 将细胞培养皿放置冰上并用冰预冷1x PBS洗涤细胞2次。
2) 吸出PBS，然后加入冰预冷的裂解缓冲液（每107个细胞/100 mm培养皿/150 cm2培养瓶加1 mL；每 5x106 个细胞/60 mm培养皿/75 cm2培养瓶加 0.5 mL）。
3) 用细胞刮刀将贴壁细胞从培养皿上刮下，然后轻轻将细胞悬液转移到预冷的小EP管中。
4) 4℃下持续振摇 30min。或冰上裂解10min后，置于细胞破碎仪中超声破碎，至澄清即可。
5) 4℃，12,000 rpm 离心15min。
6) 轻轻地从离心机中取出离心管放置在冰上。将上清液吸出转移到放置在冰上预冷的新EP管中，弃去沉淀。
2、组织裂解液的制备
1) 用干净器械解剖目标组织，最好在冰上，并且越快越好以防蛋白酶降解（组织中有红细胞会影响部分靶点的检测，因此在取组织前进行灌流处理）。
2) 将组织放入圆底离心管或EP管中，浸入液氮中“速冻”，然后样本可以在-80°C储存备用，或放在冰上立即匀浆。
3) 对于一块约5 mg的组织，向管中迅速加入约300 μL裂解液，并用电动匀浆器匀浆，在 4℃ 下（例如将回旋振荡器放入冰箱）持续振摇2h。裂解液的体积必须根据组织总量决定；蛋白提取物不宜过稀释，以免造成蛋白损失，并尽量减少样本体积，以便凝胶上样。或者，通过液氮研磨的方式，在研磨器中将组织研磨成粉状，加入适量裂解液后超声至溶液澄清即可。
4) 4℃，12,000 rpm 离心15min。轻轻地从离心机中取出离心管放置在冰上。将上清液吸出转移到放置在冰上预冷的新EP管中，弃去沉淀。
三、电泳
三、电泳
1. 根据目标蛋白的分子量(MW)配置SDS-PAGE胶。
1. Tip 1：小分子电泳缓冲液（Tris-Tricine/SDS）比Tris-glycine/SDS缓冲液能更好的分离低分子量蛋白 (<10 kDa)；
2. Tip 2：梯度胶可以提供更清晰的条带，在一种凝胶上提供更大的蛋白检测范围，如4-20%分离范围15-250 kDa，3-8%分离150-500 kDa。
3. 在EP管中制备样品。添加5x SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，细胞或组织裂解液的总蛋白上样量为10-40ug，纯化蛋白的上样量为10-100ng。
4. 在100 V下跑胶1-2h。可以根据实际情况调整，避免高电压导致温度过高致使蛋白降解。
二、蛋白转印（以湿转为例）
2. Tip 2：梯度胶可以提供更清晰的条带，在一种凝胶上提供更大的蛋白检测范围，如4-20%分离范围15-250 kDa，3-8%分离150-500 kDa。
3. 在EP管中制备样品。添加5x SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，细胞或组织裂解液的总蛋白上样量为10-40ug，纯化蛋白的上样量为10-100ng。
4. 在100 V下跑胶1-2h。可以根据实际情况调整，避免高电压导致温度过高致使蛋白降解。
二、蛋白转印（以湿转为例）
1. 推荐使用PVDF膜（只有当目标蛋白分子量<20kDa时，使用0.22μm孔径的膜）。将膜在甲醇中浸泡30秒，用超纯水冲洗两遍，然后用新鲜配制的湿法转膜液浸泡。将滤纸和海绵也浸泡在转膜液中。
2. 将胶从电泳槽中取出，浸泡在转膜液中。
3. 以海绵/滤纸/膜/胶/滤纸/海绵的方式，将其紧密排列，确保各个夹层之间没有气泡（如下图所示）。
5. 转移完成后，将膜取出，用超纯水冲洗两遍，放入封闭液中进行封闭，室温2h或4℃过夜。
五、免疫印迹
五、免疫印迹
1. 将膜从封闭液中取出，用1x TBST洗膜三次，每次5min。
2. 根据推荐稀释度用抗体稀释液稀释抗体，37℃孵育1h或4°C过夜。
3. Tip：不同抗体稀释液可能会影响抗体的灵敏度，请使用抗体说明书推荐的抗体稀释液。
4. 用1xTBST清洗膜三次，每次10min。
5. 根据推荐稀释度稀释二抗，将膜放入其中孵育，室温孵育1h 。
6. 用1xTBST清洗膜三次，每次10min。
7. 洗膜过程中可以准备配制ECL，将ECL化学发光试剂盒（Catalog# K1801/1802）A液和B液混匀后使用。
8. Tip：使用不同灵敏度的ECL，遵循有弱到强的顺序，也就是说先用低灵敏度ECL，如果曝光强度较弱更换高灵敏度ECL。
9. 将ECL底物和膜充分反应后，用保鲜膜将膜包裹在暗夹上或放入凝胶成像仪中读取，根据多次曝光时间确定最佳曝光时间。