流式细胞术专题：实验结果更好看，选对流式图是关键~
流式细胞术是一种生物学技术，用于对悬浮于流体中的细胞或其他生物粒子进行计数、分选以及多种参数分析，这种技术是通过检测标记的荧光信号，实现高速、逐一的细胞定量分析和分选的技术，被广泛的运用于从基础研究到临床实践的各个方面，涵盖了细胞生物学、免疫学、血液学、肿瘤学、药理学、遗传学及临床检验等领域，在各学科中发挥着重要的作用。
流式细胞术的特点是：测量速度快、被测群体细胞数目大、能进行多参数测量，是一种当代最先进的细胞定量分析技术之一。
下排，左-右：热度图、散点图、直方图、共染图
那么多种图，科研小白们常常感到迷茫：
这些都是什么类型的流式结果图，它们的区别是什么？在自己做流式实验过程中，应该用哪种图进行展示比较适合呢？今天，HUABIO带大家看看常用的四类流式图，了解它们的特点和适用范围，让你研究不迷糊！
一、直方图（Histograms）
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直方图示例：
CD45 (HA600127F)
流式直方图形成的原理与统计学中的直方图相似,是在统计学直方图的基础上进一步发展而成的。
流式直方图是在此统计直方图的基础上，使统计区间不断地缩小，缩小到甚至可以认为一个值就是一个统计区间，使统计的细胞数量不断地增加，增加到以万计，甚至以十万计时，相邻的小统计区间内的细胞数相差不多，这时的直方图好像是由光滑的曲线所围成的。其实，这只是直方图统计的细胞数达到一定量时视觉上的一个假象，这个由光滑的曲线围成的流式直方图实际上是由无数个非常小的统计区间组成的。
为了方便理解，可以认为x轴上的一个点就是一个统计区间，而曲线上该点对应的y轴值就是x轴代表的通道的荧光信号值对应的细胞数。这时，统计细胞群体比例时可以通过计算曲线下所围的面积的比例来表示。
日常实验中，横坐标（x轴）代表荧光信号或散射光信号相对强度，可以是线性或对数坐标。纵坐标（y轴）表示数量，曲线上的每个点表示所分析的细胞群体中散射光强度或荧光强度等于所对应上值的细胞数。
直方图分析数据注意事项：
① 适用于分析处理周期，不能比较不同标记之间的表达量。如一号样本单标记CD3、二号样本单标记CD4，那么CD3与CD4表达量不能用直方图进行比较。
② 直方图的形状（直方图的高度及宽度）取决于仪器的类型、处理软件和样本。
③检测目的细胞非常少（即检测的细胞在一个细胞群体中所占的比例特别少），由于需要统计大量的数据，直方图将会覆盖一些稀有细胞的表达丰度，建议选用散点图为展示数据方式。
流式直方图只能表示一个通道的信息，如果需要同时表示两个通道的信息，那么可以选用流式散点图。它是双变量图的基本图形，相对于单参数直方图，其分析通量更高。
流式直方图只能表示一个通道的信息，如果需要同时表示两个通道的信息，那么可以选用流式散点图。它是双变量图的基本图形，相对于单参数直方图，其分析通量更高。
二、散点图（Dot plots）
流式散点图也是采取坐标轴的方式，x轴表示一个通道的值，y轴表示另一个通道的值，图中每一点代表一个细胞，该点所对应的横坐标值就是该点所代表细胞的x轴通道的值，所对应的纵坐标值就是该点所代表细胞的y轴通道的值。
一般在流式分析过程中，先利用FSC-SSC物理图根据细胞的大小和颗粒度将细胞进行分群，散点图可以观察到较小比例细胞群，设门后可以赋予门控颜色，便于观察门控细胞群在其他图中的分布。十字门左下角是双阴性群，右下角和左上角是单阳群，右上角是双阳群。
插播一条TMI：什么是门？
门（gate）是流式分析过程中一个较为重要的概念，流式分析时有时不希望所有的样品细胞都显示于流式图中，而是希望只显示感兴趣的细胞，排除其他非相关细胞的干扰，使显示的信息更加直观，更具有针对性。
门（gate）是流式分析过程中一个较为重要的概念，流式分析时有时不希望所有的样品细胞都显示于流式图中，而是希望只显示感兴趣的细胞，排除其他非相关细胞的干扰，使显示的信息更加直观，更具有针对性。
例如，分析CD25+调节性T细胞占CD4+T细胞的比例时，样品细胞是小鼠脾脏单个核细胞，此时可以根据CD4的表达情况，将CD4+T细胞设门显示于一个新的流式图中，则该流式图只显示所设门内的细胞，即只显示CD4+T细胞，其他无关细胞不会被显示。在相应散点图中x轴代表CD4信息，y轴代表CD25信息，这样就可以非常直观地计算出调节性T细胞的比例。
散点图在显示足够多events下的细胞分群上缺乏细节，流式仪器记录的events达到50000以上时，CCR7的阳性群与阴性群已经没有明显界限，但当用等高线图或者密度图时，可以明显改善这一点。
散点图在显示足够多events下的细胞分群上缺乏细节，流式仪器记录的events达到50000以上时，CCR7的阳性群与阴性群已经没有明显界限，但当用等高线图或者密度图时，可以明显改善这一点。
三、等高线图(Contour plots)
等高线图与散点图较为相似，是一种显示数据密度的形式，使用借助地理中的等高线显示数据的相对强度（细胞的密集程度）。等高线的每条线包含events的百分比，由所用软件决定。
环线代表的是细胞密度的区域，环线集聚越多的地方表示此区域细胞密度变化越快，细胞最稀疏的地方还是散点，；等高线图可以直观体现细胞群的集中点，环线的中央区域代表一个细胞群的集中点。主要用于突出显示散点图中距离较近且不容易区分的细胞群。
单纯的等高线图不能显示低密度的群体颗粒或者异常值，比较好的策略为等高线图与点图结合起来使用。
四、密度图（Density plot）
%20&%20VISTA%20%20(HA720183F)..png)
CD14 (HA720184F) & VISTA (HA720183F).
流式密度图也是双参数图，但是与散点图相比，可以显示细胞群体的整体密度分布，颜色越深代表细胞密度越大，其余的信息和散点图类似。密度图能够表示一个标记的表达水平，同时还能显示给定区域中事件的相对数量（密度）。
常用的密度图形式有三种：密度图、斑马线图、伪彩图，日常实验中可以选择自己一种喜欢的形式应用。
当然，在具体的数据分析过程中，可以根据样本细胞的特点以及实验方案的设计选择适合自己的分析图，这样不仅有助于在分析过程中更快地找到目的细胞群，而且在一定程度上可以使分析结果更加清晰明了，有助于文章的发表。
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