免疫组织化学（冰冻切片，IHC-Fr）
冰冻切片的制备
一、试剂
1×PBS、4% PFA、15%的蔗糖溶液（1×PBS配制）、30%的蔗糖溶液（1×PBS配制）、OCT包埋剂。
二、程序
以小鼠脑组织固定为例。
1. 固定
小鼠心脏灌流（详见组织灌流固定方案），剖取新鲜组织立即投入4% PFA中固定18h左右（4℃过夜）。
2. 脱水
1）修整组织后放于15%的蔗糖溶液（1×PBS配制）中，于4℃冰箱脱水至组织沉底（约8h）；
2）转入30%的蔗糖溶液（1×PBS配制）中，于4℃冰箱脱水至组织沉底（过夜，约15h）。
*组织的蔗糖脱水时间以沉底为准。
3. 包埋
将沉糖后的脑组织用滤纸将表面水稍吸干后，使表面完全干燥。在成型的铝箔纸模具底部倒入少量OCT包埋剂，将脑组织腹侧向下平放入模具中，使大脑中缝平行于模具长边。加入OCT包埋剂至液面高于脑组织2~3 mm，速冻台进行包埋。
4. 切片
1）打开冰冻切片机，箱体温度设置为-20℃，样品头温度设置为-22℃（可按实际切片情况调整，-18℃~25℃）；
2）安装、预冷刀片和防卷板；
3）在样品托表面加入少量OCT包埋剂；
4）将速冻完成的脑组织从铝箔纸模具中取出切除多余的OCT包埋剂，然后将脑组织按切片所需方向粘贴在样品托上；
5）将样品托放入冰冻箱速冻区域速冻，使OCT包埋剂迅速凝固，以将脑组织固定在样品托上；
*若是提前制备并保存在-80°C的脑组织，将其固定在样品座上以后，需在冰冻箱内复温约30 min。
6）调整切片刀片与标本之间的距离（至与标本距离1mm左右）；
7）调整切片厚度等相关参数后转动摇杆进行切片，切片厚度为10~20μm；
8）使用粘附载玻片平稳轻压组织，使其平整的吸附到载玻片上；
9）-80℃长期保存，-20℃短期保存。
5. 注意事项
1）在将脑组织包埋前须完全除去表面的液体，防止冷冻时形成冰晶损伤组织；
2）OCT中不能有气泡，特别是样品附近的气泡会影响冰冻切片效果；
3）在将-80℃保存的组织粘贴在样品托上后需在冰冻箱内复温，避免直接切片时因组织温度过低出现裂痕；
4）-20℃保存时间约为1个月，如需长期保存请置于-80℃，可保存一年。
6. 常见问题与解决方案
1）脑片卷曲：切片刀温度较高/防卷板安装的位置太过靠前/脑组织未速冻完全，可适当向后调节防卷板位置、提前便安装防卷板和刀片预冷；
2）脑片褶皱：冰冻箱中操作温度过高，应将适当调低箱体温度；
3）脑片破碎：防卷板上存在缺口或冰冻箱内温度过低，应及时更换防卷板或适当调高箱体温度。
冰冻切片的染色
1. 切片从冰箱取出后室温恢复15min后，用1×TBST浸洗3次，每次3 min。
2. 抗原修复：如需修复，可采用下述两种修复方式
2.1 微波修复：透明烧杯中加入适量 1×柠檬酸（PH6.0）缓冲液（根据切片数量调整），放入组织切片后置于微波炉内， 大火加热约3min至沸腾即可 ；室温冷却30min后，自来水流水冲洗冷却至室温。
2.2 1％十二烷基硫酸钠溶液（SDS）修复：用1% SDS溶液覆盖组织切片，室温下修复5min后，用PBS缓冲液冲洗3次，每次3-5min。
3. 透膜与封闭：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈，在圈内滴加封闭液（1xTBST配制的含10%阴性山羊血清，0.3M甘氨酸和0.2%的Triton X-100）覆盖组织，置于湿盒内室温孵育30~60min。
4. 清除封闭液，然后每个切片加入用推荐的抗体稀释剂稀释的一抗（通常100μl/组织），置于湿盒4℃孵育过夜。（从4℃冰箱拿出后室温放置30min后再进行后继实验操作）。
5. 第二天从4℃冰箱拿出湿盒，室温平衡30min。
注：使用直标一抗检测时，此步骤结束后即可进行封片。
6. 用1×TBST浸洗3次，每次3 min。切片拍干后在圈内滴加100μl预先稀释好的荧光标记羊抗小鼠/兔IgG（含DAPI 1:10000或Hoechst 33258）覆盖组织，室温孵育1h。
7. 封片：用1×TBST浸洗3次，每次3 min。清洗完毕后用抗荧光淬灭封片剂封片（封片时组织上不要有气泡，避免影响拍照）。