石蜡组织切片免疫荧光(IF-tissue)
组织免疫荧光(IF-tissue)
一、试剂
二甲苯、无水乙醇、95%酒精、1×Tris-EDTA（PH9.0）缓冲液、1×柠檬酸（PH6.0）缓冲液、1×TBS-T、0.25％Triton X-100、10%阴性山羊血清、0.3M甘氨酸、荧光标记羊抗小鼠／兔IgG、抗荧光淬灭剂。
二、程序
注意：整个操作过程应保持切片处在湿润环境中（湿盒），避免切片变干，否则极易产生非特异染色。
1. 石蜡切片脱蜡至水
在对石蜡切片染色前，须进行脱蜡处理，才能使切片顺利染色。
l 试剂
二甲苯、无水乙醇、95%酒精
l 程序
1）二甲苯Ⅰ 10min；
2）二甲苯Ⅱ 10min；
3）二甲苯Ⅲ 10min；
4）无水乙醇Ⅰ 3min；
5）无水乙醇Ⅱ 3min；
6）95%酒精 3min；
7）流水冲洗 3min。
*冬季可在执行脱蜡程序前将切片置于75℃烤箱中5min。
*试剂须定期更换，脱蜡二甲苯、酒精通常两周更换一次，或根据脱蜡片数确定更换频率。
2. 石蜡切片抗原修复
修复方式可根据抗原进行调整，修复后进行透膜与封闭。
1）水煮修复：高压锅中加入约1L 1×Tris-EDTA（PH9.0）缓冲液（根据切片数量调整），用电磁炉加热使其沸腾3-5min确保低火下无气泡；将组织切片放入高压锅内，电磁炉调至低功率维持温度在90-95℃煮20min，盖上锅盖，无需加压力阀（中间可检查修复液是否没过切片以及切片上是否有气泡）。室温冷却10min后，流水冲洗冷却至室温。
2）高压修复：高压锅中加入1L 1×柠檬酸（PH6.0）缓冲液（根据切片数量调整），不盖紧状态下加热至沸腾，将组织切片放入高压锅内，加阀，加热至均匀喷气后，维持2min
，室温冷却10min后，待压力阀落下打开高压锅盖，流水冲洗冷却至室温。
*本方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。
3）微波修复：透明烧杯中加入约650mL 1×Tris-EDTA（PH9.0）缓冲液（根据切片数量调整），放入微波炉，大火加热至沸腾；将组织切片置于盛有煮沸的Tris-EDTA缓冲液（PH9.0）的修复盒内，将微波炉调至小火维持温度95-100℃ 20min（分两次，每次10min，中间要检查溶液是否没过切片以及切片上是否有气泡）。室温冷却10min后，自来水流水冲洗冷却至室温。
*抗原修复的原因：在甲醛或多聚甲醛固定过程中，组织中部分抗原发生了蛋白之间交联及醛基的封闭作用，从而失去抗原活性。通过抗原修复，可以使得细胞内抗原决定簇重新暴露，提高抗原检测成功率。
3. 透膜与封闭
切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止抗体流走，注意组化笔尖不能沾水，画的圈要大小适中，距离组织0.5cm左右），在圈内滴加0.25％的Triton X-100与10%阴性山羊血清+ 0.3M甘氨酸的混合液（用1×TBS-T配制）覆盖组织，切片平放于湿盒内室温透膜孵育30min。
4. 一抗孵育
用抽吸机抽去大部分封闭液，在圈内滴加用1×TBS-T稀释好的一抗覆盖组织（通常100ul/组）。切片平放于湿盒内4℃孵育过夜（从4℃冰箱拿出后室温放置30min后再进行后继实验操作）。
*使用直标一抗检测时，此步骤结束后即可进行封片。
5. 二抗孵育
玻片用1×TBS-T浸洗3次，每次3 min。切片拍干后在圈内滴加100ul预先用1×TBS-T稀释好的荧光标记羊抗小鼠／兔IgG（含 DAPI 1:10000或Hoechst 33258）覆盖组织，室温孵育2-3h。
6. 封片
玻片用1×TBS-T浸洗3次，每次3 min。清洗完毕后用抗荧光淬灭封片剂封片（封片时组织上不要有气泡，避免影响拍照）。