Anti-Myc Magnetic Beads

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产品描述

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Anti-Myc免疫磁珠来源于Anti-Myc [A3C8-R]重组鼠单克隆抗体,与直径为30-150μm的琼脂糖磁珠共价偶联。[A3C8-R]抗体能识别包含Myc多肽序列(EQKLISEEDL)的融合蛋白。[A3C8-R]可特异性地结合哺乳动物和细菌提取物中的N端Myc融合蛋白、C端Myc融合蛋白。

Anti-Myc免疫磁珠可用于常用的免疫沉淀程序检测和捕获Myc标记的融合蛋白。可以通过磁性吸附实现快速高效的分离,无需离心操作,以促进实验过程。

产品性能:

产品形式:Anti-Myc免疫磁珠保存在PBS,pH7.4添加防腐剂的缓冲液中,以20%的悬浮液形式提供。

抗体浓度:每1mL纯磁珠结合8mg Myc 抗体。

结合能力:每1mL纯磁珠可结合≥0.6mg Myc融合蛋白。

辅助设备:磁力架、离心管、96孔板。

注:不要使用磁力搅拌系统。磁力搅拌系统会破坏磁珠结构。

保存条件:

Anti-Myc免疫磁珠建议在2-8℃下储存,可稳定保存2年。请勿-20℃保存,冷冻磁珠将不可逆转地损坏磁珠结构。

注意事项和免责声明

本产品仅限于科学研究使用,不得用于临床诊断或治疗。

使用说明:

一、样品制备

建议将蛋白裂解液控制在pH6-8,NaCl或KCl浓度≥0.15M可获得较好的实验效果。

蛋白裂解液需要离心(10,000-20,000×g,15min)才能去除干扰蛋白质结合的细胞碎片和微粒。如想获得更好的实验效果,蛋白裂解液还可通过0.45 µm或0.22 µm滤器过滤。

二、使用Anti-Myc免疫磁珠进行免疫沉淀(IP)

此程序推荐用于纯化少量 Myc融合蛋白。

以下方法是单个免疫沉淀(IP)反应的示例。对于多个IP反应,根据要处理的样品数量计算所需试剂的体积。对于IP反应,建议每个反应(1x10^6细胞 或500μL裂解液)使用10-20µL的磁珠悬浮液。

注意:该方法推荐使用两个对照。第一个对照是IP与Myc融合蛋白(阳性对照)。 第二个是不含蛋白质的试剂空白(阴性对照)。

1.通过颠倒混匀彻底重悬磁珠。确保Anti-Myc免疫磁珠是均匀的悬浮液。取出适当的体积以供使用,加入到合适的离心管中。为减少对磁珠的损坏,建议剪掉移液器吸头的末端。

2.将离心管放入适当的磁力架中以收集磁珠。吸出并丢弃存储缓冲液。

3.用10倍磁珠悬浮液体积的TBS清洗磁珠三次。确保去除大部分洗涤缓冲液并且没有磁珠被丢弃。

注意:对于多个IP样品,一起清洗所有样品的磁珠。洗涤后,将磁珠重新悬浮在TBS中,并根据测试的样品数量重新分配磁珠。将离心管放入适当的磁力架中以收集磁珠,吸出并丢弃TBS。

4.将500µL处理好的细胞裂解液添加到洗涤过的磁珠中。(使用的细胞裂解液体积取决于转染细胞中 Myc融合蛋白的表达水平,可根据样品中目的蛋白丰度来调整裂解液的体积)。对于阳性对照,将500μL TBS 和2µL 50 ng/µL Myc融合蛋白(~100ng)添加到洗涤过的磁珠中。对于阴性对照,仅添加500μL的裂解缓冲液,不含蛋白质。

5.轻轻摇动(推荐使用旋转混匀仪)所有样品和对照1小时。为了提高结合效率,可将结合步骤延长至4℃过夜反应。

6.将离心管放在适当的磁力架中以收集磁珠。用移液器吸头(推荐使用细长的吸头或者1mL吸头上套200µL吸头来使用)去除上清液(注意防止吸头沾到磁珠)。

7.用10倍磁珠悬浮液体积的 TBS清洗磁珠三次。

8.洗脱:

根据后续实验要求,可以选择如以下3种方法之一进行洗脱。

8.1酸性洗脱法

本方法为非变性法,比较快速且高效。洗脱后的蛋白保持原有的生物活性,便于后续分析检测。

8.1.1溶液的配制:酸性洗脱液(0.1M 甘氨酸,0.2M 精氨酸,pH2.7),中和液(1M Tris-HCl, pH9.0)。

8.1.2每10ul原始磁珠悬浮液,加入100ul酸性洗脱,混匀后置于旋转混合仪上,室温孵育5分钟。注:孵育时间不宜超过15分钟。

8.1.3孵育完毕后,置于磁力架上分离磁珠至溶液澄清,将上清转移到新的离心管中,并立刻加入10ul中和液,混匀。

8.1.4为了获得最大的洗脱效率,可重复步骤8.1.2和8.1.3,并将相同样品合并。

8.1.5洗脱并中和的目的蛋白置于4℃待用,或者-20℃或-80℃长期保存。

注:1)酸性洗脱法虽然高效,但仍可能低于SDS-PAGE上样缓冲液洗脱法。

2)由于目的蛋白的差异可能对酸性洗脱法的洗脱效率有一定的影响,如果对洗脱效率的要求比较高,可对酸性洗脱液的pH在2.5-3.1之间进行一定的调整,相应的中和液的pH值或量也要进行一定的调整。

8.2 SDS-PAGE上样缓冲液洗脱法

本方法为变性法,得到的蛋白样品适合SDS-PAGE电泳或Western Blot检测。

8.2.1每10ul原始磁珠体积的磁珠,加入25ul 1X SDS-PAGE上样缓冲液,95℃加热10分钟。

8.2.2置于磁力架上分离磁珠至溶液澄清,取上清进行SDS-PAGE电泳或Western Blot检测。

8.3 3X Myc 竞争洗脱法

本方法为非变性法,洗脱效率高,且洗脱后的蛋白保持原有的生物活性,便于后续分析检测。

8.3.1 3X Myc多肽洗脱液的配制:取适量3X Myc多肽溶解于1X TBS+1%Triton+0.1%SDS中,使其终浓度为300μg/ml。

8.3.2每10ul原始磁珠体积,加入100ul 3X Myc多肽洗脱液(300μg/ml),混匀后置于旋转混合仪上,室温摇晃孵育30-60分钟,或4ºC孵育1-2小时。为了提高洗脱效率,可延长孵育时间或重复洗脱。

8.3.3孵育完毕后,置于磁力架上分离至溶液澄清,将上清转移到新的离心管中。上清即为洗脱的Myc标签蛋白。

8.3.4洗脱的Myc标签蛋白置于4ºC待用,或者-20ºC或-80ºC长期保存。

注:作为 SDS-PAGE 样品的洗脱会导致 Anti-Myc磁珠损坏。磁珠不能再次使用,因为样品缓冲液中的 SDS 会使抗体变性。煮沸还会破坏磁珠结构。

以下方法是为小规模单个样品的亲和纯化实验编写的。

对于批量纯化实验,建议每次反应使用250 µL磁珠悬浮液(约50 µL纯磁珠)。对于96孔板的使用,建议每孔使用10 µL纯磁珠。磁珠用量可根据样品中目的蛋白丰度和使用磁力架的类型做出对应调整。

三、Myc标签蛋白纯化

纯化Myc标签蛋白,磁珠可用于批量或以96孔板的形式纯化。对于较大体积的蛋白质提取物,建议使用批量处理方式从大量提取物中快速捕获目标蛋白。

使用Anti-Myc免疫磁珠纯化Myc融合蛋白的处理方式:

Anti-Myc免疫磁珠储存在20%悬浮液中。使用前可根据纯化体系大小选择是否去掉保存液,并用缓冲液平衡磁珠。平衡在室温下进行。只取出纯化所需要的磁珠量

如果想让磁珠在 TBS(50 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、pH 7.4)缓冲液中停留较长时间(>24小时),建议向磁珠缓冲液中添加抗菌剂(例如 0.05% ProClin 300)。

1.轻轻颠倒以彻底重悬磁珠。确保 Anti-Myc免疫磁珠是均匀的悬浮液状态。取出适当的体积以供使用。

2.将磁珠转移到合适大小的离心管中。用5倍磁珠悬浮液体积的TBS(50 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、pH 7.4)重新悬浮来平衡磁珠,充分混合。将离心管放入适当的磁力架中以收集磁珠。取出并丢弃存储缓冲液/TBS混合物。

3.再次添加10倍磁珠悬浮液体积的TBS(50 mM Tris HCl,150 mM NaCl,pH 7.4)重悬来平衡磁珠,充分混合。将离心管放入适当的磁力架中以收集磁珠。取出并丢弃存储缓冲液,重复清洗2次。

4.在室温下将蛋白质提取物(参见样品制备)与平衡好的磁珠(步骤3)孵育约1小时,同时轻轻混合以捕获Myc融合蛋白。混合应在旋转混匀仪上进行。

5.结合步骤完成后,将离心管放入适当的磁力架中收集磁珠。移除上清液。

6.用TBS清洗磁珠以去除非特异性结合的蛋白质。洗涤应使用20倍磁珠悬浮液体积的TBS,共清洗3次。

注意:洗涤过程可以通过测量上清液在280nm处的吸光值来监测。继续洗涤磁珠,直到从磁珠吸出的洗涤液与洗涤液 (TBS) 空白之间的吸光值差异<0.05。

7.Myc融合蛋白可以通过低pH值方法或通过与3X Myc多肽竞争从磁珠上洗脱下来。

7.1在低pH 条件下用甘氨酸洗脱:

用10倍磁珠悬浮液体积的(0.1M甘氨酸,0.2M精氨酸,pH 2.7)的洗脱液加入到磁珠中,室温孵育5分钟,洗脱结合的 Myc 融合蛋白,向洗脱液中加入适量的中和液(按每100ul洗脱液加入10µL 1M Tris-HCl,pH 9.0的中和液),孵育时间不要超过15分钟。洗脱后尽快将磁珠重新平衡至中性pH值。

7.2通过与3X Myc多肽的竞争洗脱:

使用5倍磁珠悬浮液的含有3X Myc多肽(300 µg/mL)的1X TBS + 1% Triton X-100 + 0.1% SDS溶液竞争洗脱,洗脱结合的 Myc融合蛋白。

8. 清洁磁珠

建议在使用后立即清洁磁珠,方法是用3倍体积的(0.1M甘氨酸,0.2M精氨酸,pH 2.7)的洗脱液清洗磁珠。磁珠应立即在TBS中重新平衡,直到流出物处于中性pH值。

9. 储存磁珠

清洗磁珠后,将离心管放入适当的磁力架中收集磁珠,并去除缓冲液。磁珠可以作为 20% 的悬浮液储存在PBS,0.05% ProClean 300,pH7.4中。将磁珠储存在 2-8℃,避免磁珠干掉。

四、结果展示

Immunoprecipitation

Anti-Myc [A3C8-R] Magnetic Beads: Cat.No. HAK21024: Purification of Two Different Myc-tagged fusion protein from 293T transfected with Myc-fusion protein expression vector. 20ul Anti-Myc [A3C8-R] Magnetic Beads was used for IP per lane.

Lane 1-4: 293T transfected with Myc-fusion protein expression vector containing an C-terminal Myc tag, whole cell lysate

Lane 1’-4’: 293T transfected with Myc-fusion protein expression vector containing an N-terminal Myc tag, whole cell lysate

产品性能

存放说明