如何跑出好看的内参条带，有这一篇指南就够了!
内参即是内部参照（Internal Control），对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白。它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。内参抗体（Internal Control Antibody）是对内参蛋白进行检测，用以校正蛋白定量过程中的实验误差以及验证转膜、显色等步骤是否正常。
内参的作用
要检测一个基因的表达产物是否正确，或者比较表达产物量的相对变化，首选方法是Western Blot。因为Western Blot操作相对简单方便，既可以定性分析表达产物，同时还可以指示目的蛋白量的相对变化。在实验中，可能存在总蛋白浓度测定不准确，或者蛋白质样品在上样时产生的操作误差。特别表达量不高时，蛋白定量或上样的误差很有可能影响结果的分析。
内参抗体可用于评价蛋白质免疫印迹法的效率和比较凝胶中每孔的蛋白上样量。此类对照可帮助确定样品间表达水平的差异是由细胞裂解物的实际蛋白水平导致，或是由上样量的差异导致。
常见内参类型
哺乳动物细胞中常用的内参种类很多且分布广泛，包括但不限于：Actin (肌动蛋白),Tubulin (微管蛋白), GAPDH，Lamin B1, HDAC, PCNA等。细胞浆、细胞核、细胞膜内参为三大常用内参。其中，β-actin，GAPDH，β-tubulin为最常用的三大细胞浆内参靶点。
PART.01：GAPDH
GAPDH是参与糖酵解的一种关键酶，由4个30-40kDa的亚基组成，分子量146kDa，检测条带大约在36kDa。
该酶基因为管家（house keeping）基因，几乎在所有组织中都高水平表达，在同种细胞或者组织中的蛋白质表达量一般是恒定的，且不受含有的部分识别位点、佛波脂等的诱导物质的影响而保持恒定，故被广泛用作抽提total RNA，poly(A)+ RNA，Western blot等实验操作的标准化的内参。
PART.02：Actin
肌动蛋白是一类形成微丝的球状多功能蛋白质 。它基本上存在于所有真核细胞中 ，它可以以超过100μM的浓度存在；其质量约为42kDa，直径为4至7nm。
PART.01：GAPDH
GAPDH是参与糖酵解的一种关键酶，由4个30-40kDa的亚基组成，分子量146kDa，检测条带大约在36kDa。
该酶基因为管家（house keeping）基因，几乎在所有组织中都高水平表达，在同种细胞或者组织中的蛋白质表达量一般是恒定的，且不受含有的部分识别位点、佛波脂等的诱导物质的影响而保持恒定，故被广泛用作抽提total RNA，poly(A)+ RNA，Western blot等实验操作的标准化的内参。
PART.02：Actin
肌动蛋白是一类形成微丝的球状多功能蛋白质 。它基本上存在于所有真核细胞中 ，它可以以超过100μM的浓度存在；其质量约为42kDa，直径为4至7nm。
肌动蛋白由一个大的基因家族编码，人类有6个肌动蛋白基因，有些植物有超过60个肌动蛋白基因（尽管大多数是假性基因，它们不编码功能性肌动蛋白）。每个功能性肌动蛋白基因编码一种不同的蛋白质亚型。肌动蛋白异构体根据其总电荷不同被分为三组：α-肌动蛋白、β-肌动蛋白和γ-肌动蛋白。
PART.03：Tubulin
组成微管的蛋白质称为微管蛋白——tubulin。微管蛋白是球形分子，在真核生物中，微管是细胞骨架的主要成分之一，并且在许多过程中起作用，包括结构支持，细胞内转运和DNA分离。
组成微管的蛋白质称为微管蛋白——tubulin。微管蛋白是球形分子，在真核生物中，微管是细胞骨架的主要成分之一，并且在许多过程中起作用，包括结构支持，细胞内转运和DNA分离。
微管蛋白超家族含有六个微管蛋白（α-，β-，γ-，δ-，ε-和ζ-微管蛋白）。α-微管蛋白(α-tubulin)和β-微管蛋白(β-tubulin)，这两种微管蛋白约占微管蛋白总量的80%-95%。
PART.04：Lamin B1
核纤层蛋白是核纤层的结构部件，用于支撑核被膜并参与细胞周期中核被膜的解体和再形成在动物细胞中，3种基因编码了至少7种核纤层蛋白。LMNA基因通过可变剪接编码A型和C型核纤层蛋白，而LMNB1和LMNB2分别编码核纤层蛋白B1和B2（Lamin B1和B2）。B型核纤层蛋白存在于每个细胞。A型核纤层蛋白在原肠胚形成后表达，C型核纤层蛋白的表达是组织特异性的。
PART.04：Lamin B1
核纤层蛋白是核纤层的结构部件，用于支撑核被膜并参与细胞周期中核被膜的解体和再形成在动物细胞中，3种基因编码了至少7种核纤层蛋白。LMNA基因通过可变剪接编码A型和C型核纤层蛋白，而LMNB1和LMNB2分别编码核纤层蛋白B1和B2（Lamin B1和B2）。B型核纤层蛋白存在于每个细胞。A型核纤层蛋白在原肠胚形成后表达，C型核纤层蛋白的表达是组织特异性的。
在核纤层蛋白中，Lamin B1往往被用作内参。其分子量为66Kd，适合补充使用，但对于没有核被膜的样品，是不适合作为内参的。
PART.05：Histone H3
组蛋白是核小体的核心成分，在转录调控、DNA 修复、DNA 复制和染色体稳定性中起着核心作用。Histone H3等由于是染色体的组成型表达组分,表达比较稳定,经常被作为最广泛的核内参使用。
PART.06：Sodium Potassium ATPase
钠钾ATP酶（Sodium Potassium ATPase），钠钾泵（sodium potassium pump）又称钠泵或钠钾ATP酶，它会使细胞外的Na+浓度高于细胞内，当Na+顺着浓度差进入细胞时，会经由本体蛋白质的运载体将不易通过细胞膜的物质以共同运输的方式带入细胞。此蛋白广泛存在于各类细胞的细胞膜上，被广泛用作为膜蛋白的内参。
组蛋白是核小体的核心成分，在转录调控、DNA 修复、DNA 复制和染色体稳定性中起着核心作用。Histone H3等由于是染色体的组成型表达组分,表达比较稳定,经常被作为最广泛的核内参使用。
PART.06：Sodium Potassium ATPase
钠钾ATP酶（Sodium Potassium ATPase），钠钾泵（sodium potassium pump）又称钠泵或钠钾ATP酶，它会使细胞外的Na+浓度高于细胞内，当Na+顺着浓度差进入细胞时，会经由本体蛋白质的运载体将不易通过细胞膜的物质以共同运输的方式带入细胞。此蛋白广泛存在于各类细胞的细胞膜上，被广泛用作为膜蛋白的内参。
内参抗体选择技巧
工欲善其事，必先利其器。内参种类多样，不同类型的内参有着不同的适用范围，如何选择适合的内参抗体呢？
01 样本来源：
选择在样品中显示强表达的上样对照：
哺乳动物的组织或者细胞样本，通常选择β-actin、Tubulin、GAPDH、LaminB、PCNA、Na+/K+-ATPase等。
植物来源实验样本则可以选择Plant actin、Rubisco等。
其他来源样本研究较少，应该参照文献报道，选择合适的蛋白作为内参。
02 目的蛋白表达部位：
（cr. Internet）
判断目的蛋白的表达部位是胞浆，细胞核，还是线粒体，并选择相应部位的内参。例如：
胞浆和全细胞蛋白：β-actin（43KD）、GAPDH（37KD）、Tubulin（55KD）等；
胞核蛋白：PCNA（29KD）、Histone H3（17KD）等；
核膜蛋白：Lamin B（66KD）等；
核膜蛋白：Lamin B（66KD）等；
胞膜蛋白：Na+/K+-ATPase（120KD）等；
线粒体蛋白：COX IV（17KD）、VDAC1（30KD）等。
03 目的蛋白分子量：
选择内参抗体时，应该考虑目的蛋白分子量的大小，选择分子量与目标蛋白分子量不相似的上样对照。
通常应该保证目的蛋白与内参蛋白分子量相差5KD以上。比如检测目的蛋白分子量为45KD，此时不适宜选择β-actin（42KD）作为内参，可以考虑选择GAPDH（36KD）作为内参。
04 实验条件与环境：
有些细胞在某些条件下内参表达出现异常，使其不适合做内参。比如某些细胞由于组织缺氧，糖尿病等因素，会导致GAPDH表达增高，不适合做内参。
此外，微管蛋白是多个药物的作用靶点，如抗癌药物紫杉醇（Taxol）、多西紫杉醇、长春碱（vinblastine）和 长春新碱（vincristine），抗痛风剂秋水仙碱（colchicine）和抗真菌药物灰黄霉素（griseofulvin）。这些药物都会影响体外和体内的微管蛋白表达。因此，有这些药物作用时，tubulin不适合被选为内参使用。
设计实验方案时应该考虑这些因素并查询相应文献，实验过程中内参表达出现异常，可应该考虑这方面因素。
05 不同细胞/组织特异性：
不同实验样本细胞/组织需选择不同内参，不能一概而论。
1 在脂肪组织里，β-Actin的表达量非常低，不适合作为内参。
2 不同组织的细胞结构会有差异性，如脑组织的 tubulin 的表达会高一些（因为神经细胞的轴突和树突都由 tubulin 维持结构），而 actin 的表达量可能会低一些。再比如，骨骼肌、心肌和平滑肌的特殊功能反而导致了 tubulin 的表达改变和特化，这种情况可以选择GAPDH。
3 细胞增殖，毒性，凋亡实验时，Lamin B1等不适合作为内参。没有核被膜的样品是不适合作为内参的。
4 血红细胞（因为其细胞结构的特殊性和需要携带氧气的功能性）样本不适合常用内参。可以选用血红细胞的结构性蛋白作为内参代替。做各种分泌液样本的时候，如血浆，乳汁，组织液等，常用内参同样不适合。由于没有完整的细胞结构，所以只能选择一些分泌蛋白作为内参，如Transferrin，或者选择其他方式作为内参。
内参抗体实验小贴士
为了获取完美的内参条带，除了选择适合的内参抗体，你还需要在实验中注意：
01 控制蛋白定量与上样
1 蛋白精准定量；
2 选择正确且表达稳定的内参指标；
3 如果第一次测试内参不平齐，按照第一次内参的深浅微调下次上样量；
4 确定线性浓度，不要浓度太高。
文献报道总蛋白上样量超过10 μg时内参蛋白不够敏感，无法检测到差异，所以一般情况下内参的理想上样量为大约5 μg，对于目标蛋白的上样量，其理想的上样量为10-20 μg。
02 调整信号强度
上样对照和目标蛋白检测到的信号应在线性范围内。
有时候我们必须提高上样量才能跑出好看的目的蛋白条带，那么就需要减弱内参的信号强度。这种情况下可以把二抗去掉，直接孵育偶联HRP抗内参抗体，这样可以大大减弱了抗体间的级联信号放大作用。
03 控制温度
分离好蛋白上清，在加Loading buffer，ddH2O前要先把金属浴仪器打开，使其尽快达到预定温度。然后快速于每个蛋白样品中加入Loading buffer，ddH2O，这样可防止蛋白的继续降解。