HUABIO 为您提供高标准ELISA试剂盒
Elisa试剂盒原理
酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)技术的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记，并依靠抗体利用高度特异性的抗体-抗原相互作用来检测目标抗原。在ELISA试剂盒检测中，抗原必须固定在固体表面，这可以直接通过包被固定在表面，也可以通过使用固定在表面上的捕获抗体来完成，此时结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性。在测定时，受检标本(测定其中的抗体或抗原)与固相载体表面的抗原或抗体起反应，用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开，再加入酶标记的抗原或抗体，通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，通过酶标仪检测有色产物的吸光度（OD值），这个数值与标本中受检物质的量直接相关。ELISA试剂盒就是通过测定已知浓度的以一定固定倍数梯度稀释的抗原或抗体和待测生物样本，得到OD值，再运用软件做出抗原或抗体的标准曲线，依据生物样本OD值反算出待测样本中目的蛋白的含量来做出定量分析的。近年来，随着分子生物学的发展，使用基因工程方法可以制备各种用途的抗原和抗体，通过筛选组合成新的检测试剂盒，再融入各种显色技术，形成多样化的诊断试剂盒，为科研和医疗领域的发展提供了极大的帮助。
ELISA的主要常用类型及步骤
ELISA主要常用类型有直接法、间接法、双抗夹心法和竞争法，直接法是用酶直接标记与抗原结合的抗体做免疫反应。间接法是利用酶标记的抗不同种属抗体(二抗)以检测与固相抗原结合的受检抗体的含量。双抗夹心法是利用包板的捕获抗体抓取目的蛋白，并与识别目的蛋白不同表位的酶标检测抗体形成夹心。竞争法是包被在固相上的参比抗原和样品中的抗原同时与酶标抗体相结合形成竞争。免疫测定技术是基于抗原抗体间的特异结合反应, 所以任何优质的诊断试剂都离不开优质的原料，如抗原、抗体、酶等。
双抗夹心ELISA
1. 抗体包被：根据实验需要用碳酸盐缓冲液（CBS）或者磷酸盐缓冲液（PBS）将包被抗体稀释到一定的稀释度，100 μL/孔包被，37℃ 2 h或者4℃过夜。2. 洗板：弃孔内液体，甩干，1xTBST洗板2次，每次浸泡1-2 min，350 μL/孔，甩干（也可以轻拍将孔内液体拍干）。
3. 封闭：每孔加入200 ~350μL封闭液，37℃，1 h。
4. 洗板：同步骤2。（备注：商品化试剂盒一般已经预包被了包被抗体在酶标板上，不需要进行1-4步骤，使用前请注意核实）。
5. 加样：分别设零孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100 μL，余孔分别加标准品或待测样品100 μL。酶标板加上盖或覆膜，37℃反应60-120 min。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。
注：加样过程中不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，一块板要在10 min内上完样品
6. 洗板：弃孔内液体，甩干，1xTBST洗板4次，每次浸泡1-2 min，350 μL/孔，甩干（也可以轻拍将孔内液体拍干）。
7. 加检测抗体：根据实验需要，将检测抗体用1xPBS稀释到一定的稀释度，100 μL/孔，37℃，45 min。
8. 洗板：同步骤6。
9. 加二抗：根据实验需要，将二抗用1xPBS稀释到一定的稀释度，100 μL/孔，37℃，30 min。
10. 洗板：同步骤6。
11. 显色：TMB显色液A液和B液按1:1充分混合，100 μL/孔，37℃孵育10 min。
12. 终止：1M硫酸溶液100 μL/孔，终止显色。
13. 酶标仪读值：以630 nm为校正波长，用酶标仪在450 nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值），在加终止液后5 min内进行读数。
14. 结果判断：
1) 每个标准品和样本的OD值须减去零孔的OD值，如设置复孔，则应取其平均值；
2) 以标准品的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，使用专业制作曲线软件进行四参数拟合（4-PL），如Origin、ELISACalc等，根据样品的OD值由标准曲线推算出相应的拟合浓度，再乘以稀释倍数即为样本的测定浓度。
间接ELISA
1. 抗原包板：将包被缓冲液稀释的抗原以100 μL/孔加入酶标板中，37℃ 2 h或者4℃过夜。2. 洗板：弃孔内液体，甩干，1xTBST洗板2次，每次浸泡1-2 min，350 μL/孔，甩干（也可以轻拍将孔内液体拍干）。
3. 封闭：每孔加入200 μL封闭液，37℃，1 h。
4. 洗板：同步骤2。
5. 加一抗：根据实验需要，用1xPBS稀释一抗到一定的稀释度，100 μL/孔，37℃，45 min。
6. 洗板：同步骤2。
7. 加二抗：稀释的HRP标记二抗，100 μL/孔，37℃孵育30 min。
8. 洗板：弃孔内液体，甩干，1xTBST洗板4次，每次浸泡1-2 min，350 μL/孔，甩干（也可以轻拍将孔内液体拍干）。
9. 显色：TMB显色液A液和B液按1:1充分混合，100 μL/孔，37℃孵育10 min。
10. 终止：1M硫酸溶液100 μL/孔，终止显色。
11. 酶标仪读值：以630 nm为校正波长，用酶标仪在450 nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值），在加终止液后5 min内进行读数。
竞争ELISA
1. 包被：根据实验将包被抗原稀释到一定的稀释度，100 μL/孔包被，37℃ 2 h或者4℃过夜。1. 洗板：弃孔内液体，甩干，1xTBST洗板2次，每次浸泡1-2 min，350 μL/孔，甩干（也可以轻拍将孔内液体拍干）。
2. 封闭：每孔加入200 μL封闭液，37℃，1 h。
3. 洗板：同步骤2。
4. 加一抗：根据实验需要，将样品稀释不同的梯度（样品可以是血清、细胞上清、尿液等），并在样品中加入特定终浓度的竞争剂，100 μL/孔，37℃，45 min。
5. 洗板：同步骤2。
6. 加二抗：稀释的HRP标记二抗，100 μL/孔，37℃孵育30 min。
7. 洗板：弃孔内液体，甩干，1xTBST洗板4次，每次浸泡1-2 min，350 μL/孔，甩干（也可以轻拍将孔内液体拍干）。
8. 显色：TMB显色液A液和B液按1:1充分混合，100 μL/孔，37℃孵育10 min。
9. 终止：1M硫酸溶液100 μL/孔，终止显色。
10. 酶标仪读值：以630 nm为校正波长，用酶标仪在450 nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值），在加终止液后5 min内进行读数。