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12-2019

细胞免疫荧光(ICC)

发布时间:2019年12月27日

细胞免疫荧光化学(ICC)检测流程

一.对于贴壁细胞

1、将准备好的贴壁细胞上清吸去,加入4%的多聚甲醛(用1XPBS配制,现配现用),室温(或37℃)固定30min;(PBS和多聚甲醛使用前应37度预热)

2、吸去多聚甲醛溶液,加入1X PBS,洗涤2次,每次5min;

3、加入0.25%的triton X-100(用PBS配制),室温(或37℃)透膜30min;

4、用PBS洗涤2次,每次5min;

5、加入10%阴性山羊血清(用PBS配制),37度封闭1h;

6、加入用10%阴性山羊血清稀释的一抗,放入湿盒4℃过夜;

7、用PBS洗涤2次,每次5min;

8、加入用10%阴性山羊血清稀释好的荧光二抗(含1:2000-5000DAPI),放入湿盒37℃孵育1h;

9、用PBS洗涤3次,每次5min;

10、荧光显微镜下观察及拍照。

二.对于悬浮细胞

1、试剂准备:

a)混合1份固定/透膜浓缩液与3份固定/透膜稀释液制备固定/透膜工作液(现配现用)。

b)以无菌亚沸水稀释10X透膜缓冲液至1X(现配现用)。

2、收集细胞5X105-1X106细胞。(如有细胞团,需过300目细胞筛)

3、含1%FBSPBS离心洗涤3次(2000g,4min,4℃)。

4、加入200ul固定/透膜工作液重悬为单个细胞,室温避光固定30min(或4℃固定过夜)。

5、无需洗涤,加入400ul 1X透膜缓冲液,充分混匀。

62000g室温离心5min,弃上清。重复洗一次。

7、加入200ul封闭缓冲液(含2%阴性山羊血清的1X透膜缓冲液),室温封闭15min

82000g室温离心5min,弃上清。

9、加入用封闭缓冲液稀释的一抗,37℃孵育1h

101X透膜缓冲液离心洗涤2次。

11、加入用封闭缓冲液稀释的荧光二抗(含1:2000DAPI),37℃避光孵育30min

121X透膜缓冲液离心洗涤2遍。

13300ul PBS重悬细胞涂布封片(用护甲油封固)。

10、荧光显微镜下观察及拍照。


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