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12-2019

免疫组织化学(IHC)(石蜡包埋)

发布时间:2019年12月24日

免疫组化检测操作流程

一.石蜡切片

1. 组织取材;

2. 4%中性甲醛固定;

3. 流水冲洗;

4. 酒精梯度脱水:75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、无水乙醇(I)、无水乙醇(II);

5. 组织透明:二甲苯(I)、二甲苯(II)(透明时间视组织情况而定);

6. 浸蜡:石蜡60℃(I)、石蜡60℃(II);

7. 包埋;

8. 切片、展片、烤片。

二.石蜡切片免疫组化操作流程

1. 组织石蜡切片60℃烤片溶蜡;

2. 脱蜡至水:二甲苯(I)、二甲苯(II)脱蜡;无水乙醇(I)、无水乙醇(II)、95%乙醇复水;

3. PBS洗涤,3min×3;

4. 阻断内源性过氧化物酶:用含0.3%过氧化氢的甲醇溶液室温阻断;

5. PBS洗涤,3min×3;

6. 抗原修复:放入沸腾的枸橼酸盐缓冲液中,煮沸15mim;自然冷却至室温;

7. PBS洗涤,3min×3;

8. 封闭:在组织上均匀滴加1%牛血清蛋白溶液封闭;

9. 一抗孵育:拍干液体,在组织上滴加相应的一抗,4℃过夜或室温孵育1h;

10. 蒸馏水冲洗3次,0.01M PBS浸洗3min×3; 0.05%吐温-20溶液浸洗数秒,拍干;

11.在组织上滴加适量反应增强液,室温孵育10min;

12. 蒸馏水冲洗3次,0.01M PBS浸洗3min×3;0.05%吐温-20溶液浸洗数秒,拍干;

13. 二抗孵育:在组织上滴加酶标羊抗小鼠/兔IgG聚合物溶液,37℃孵育30min;

14. 蒸馏水冲洗3次,0.01M PBS浸洗3min×3;在0.05%吐温-20溶液中快速浸润,拍干;

15. DAB显色液显色5min,期间注意镜下观察以控制显色程度;

16. 流水冲洗,终止显色;

17. 苏木素复染4min,流水冲洗;

18. 促蓝液促蓝1min,流水冲洗;

19. 常规酒精梯度脱水:95%乙醇(I)、95%乙醇(II)、无水乙醇(I)、无水乙醇(II)脱水;

20. 二甲苯(I)、二甲苯(II)透明1min;

21. 中性树胶封片,观察。

 

三.细胞爬片免疫组化操作流程

1. 细胞爬片,5天后进行免疫细胞组织化学染色

2. PBS清洗标本;

3. 4%多聚甲醛固定30min;PBS清洗标本,2 min×3; 

4. 0.25%Triton X-100(PBS制)孵育20min; 

5. PBS清洗标本,2 min×3;

6. 3%H2O2孵育10 min; 

7. PBS清洗标本,2 min×3; 

8. 封闭血清孵育20min; 

9. 一抗孵育4℃过夜或37℃ 1h。阴性对照最好用一抗来源血清,否则用PBS;

10. PBS清洗标本,2 min×3; 

11. 增强液室温孵育10 min

12. PBS清洗标本,2 min×3;

13. 二抗工作液孵育37℃30 min;

14. PBS清洗标本,2 min×3;

15. DAB显色(避光,镜下观察至棕色 )约3~10min

16. 蒸馏水洗2,终止显色; 

17. 苏木素复染4 min;自来水洗;

18. 促蓝夜促蓝1min,自来水洗。

19. 梯度酒精脱水:95%乙醇(I)、95%乙醇(II)、无水乙醇(I)、无水乙醇(II)脱水;

20. 二甲苯透明23min

21. 中性树胶封片,观察

 

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