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11-2019

蛋白质免疫印迹(WB)

发布时间:2019年11月04日

Western Blot 操作流程

. 样品制备

A.细胞裂解液的制备

1.胰蛋白酶消化法收集细胞。

2.离心,弃上清,向沉淀中加入RIPA裂解液(100ul裂解液/1×106个细胞),冰上裂解10min,冰浴超声60s(超1s停1s)

3.12000g 4℃离心10min,弃沉淀,收集上清溶液

4.BCA法测蛋白浓度。

5.向蛋白样品中加入5×上样缓冲液,95-100℃加热10min,待冷却至室温后-20℃保存备用

 

B.组织裂解液的制备

1.样品从-80°取出,称取适量组织放于小培养皿中,加入足量预冷的1×PBS清洗组织两到三遍

2.组织剪碎转移至液氮预冷的研钵中,加液氮充分研磨至粉末,1:20(m/v)加入裂解液(1mM PMSF),冰上裂解30min 

3.12000g 4℃离心20min,弃沉淀,收集上清溶液

4.BCA法测定蛋白浓度。

5.向蛋白样品中加入5×上样缓冲液,95-100℃加热10min,待冷却至室温后-20℃保存备用

 

 

.制胶

1.安装制胶玻璃板,并检漏。

2.配制分离胶,加入分离胶至梳孔下方1cm处。

3.用1ml无水乙醇封胶。

4.待分离胶凝固,倒掉无水乙醇,用去离子水冲洗。

5.配制浓缩胶,加入浓缩胶,立即插入梳子。

6.待浓缩胶凝固后,取下制胶玻璃板,放入电泳装置,加入电泳缓冲液,浸没胶孔。

 

.跑胶

1.混匀样品,上样。

2.加入Marker。

3.80V电压跑完浓缩胶后,更换电压至110V跑完剩余分离胶

 

.准备膜

1.裁剪PVDF膜。

2.100%甲醇中室温浸泡5~15s,倒掉甲醇,加入预冷电转液平衡20min备用

 

.转膜

1.组装“三明治结构”装置。用1×电转液浸润海绵、滤纸(稍微比凝胶大些)。

按照海绵-滤纸-胶-膜-滤纸-海绵的顺序排列。

2.4℃ 75V恒压转膜,分子量大的蛋白适当延长转膜时间。

3.将膜浸在丽春红中染色1min。

4.用去离子水洗涤,观察条带分布摇床清2min后换水,至红色消失停止换水。

5.将膜浸在封闭缓冲液中,4℃封闭过夜

6.37℃烘干,4℃保存

 

.抗体检测

1.用封闭缓冲液稀释一抗,室温摇床孵育2h。

2.用1×TBST洗膜8mim,3次。

3.用封闭缓冲液稀释二抗,室温摇床孵育1h。

4.1×TBST洗膜8mim,3次。

5.ECL显色,暗室曝光或用化学发光仪器检测。

 

.去除印记

1.蒸馏水中漂洗5分钟。
2.弃蒸馏水,加入适量的一抗二抗去除液,至少需把膜完全覆盖。在摇床上漂洗10min
3.弃一抗二抗去除液,并吸尽残余液体。加入TBS、TBST或PBS漂洗3次,每次在摇床上漂洗3-5min
4.进行封闭等后续操作。

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