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11-2019

蛋白质免疫印迹(WB)

发布时间:2019年11月05日

Western Blot 操作流程

一. 样品制备

A.细胞裂解液的制备

1.胰蛋白酶消化法收集细胞。

2.离心,弃上清,向沉淀中加入裂解液裂解细胞(20ul裂解液/0.5×106个细胞),冰上操作,裂解20min

3.12000rpm 4℃离心10min,将上清转移至一个新的离心管中,丢弃沉淀。

4.测蛋白浓度(Bradford 法或BCA法)。

5.向蛋白样品中加入上样缓冲液,100℃煮沸10min,室温冷却5min,备用。

 

B.组织裂解液的制备

1.称取适量组织块,加入少量预冷的PBS,于冰浴中迅速剪碎后放入匀浆器内研磨至糊状。 

2.加入含有1mM PMSF的细胞裂解液,在冰浴条件下吹打均匀。 

3.用超声波破碎仪处理,直到组织团块全部打散。

4. 12000rpm 4℃离心,将上清转移至一个新的离心管中。

5. 测定蛋白浓度。

6. 向蛋白样品中加入5×上样缓冲液,沸水浴处理10min,冷却后冰箱存放备用。。 

 

.制胶

1.安装制胶玻璃板,并检漏。

2.配制分离胶,加入分离胶至梳孔下方1cm处。

3.1ml水饱和正丁醇封胶。

4.待分离胶凝固,倒掉正丁醇,用去离子水冲洗。

5.配制浓缩胶,加入浓缩胶,立即插入梳子。

6.待浓缩胶凝固后,取下制胶玻璃板,放入电泳装置,加入电泳缓冲液,浸没胶孔。

 

三.跑胶

1.混匀样品,上样。

2.加入Marker

3.恒流跑胶(35~37mA,电压>150V)。

4.通常跑胶时间为1.3h

 

四.准备膜

1.裁剪PVDF膜。

2.甲醇中室温浸泡5min,倒掉甲醇,加入1×转膜缓冲液浸泡备用。

 

五.转膜

1.组装“三明治结构”装置。用1×转膜缓冲液浸润海绵、滤纸(稍微比凝胶大些)。

按照海绵-滤纸-胶-膜-滤纸-海绵的顺序排列。

2.4℃,15V恒压转膜1h。分子量大的蛋白适当延长转膜时间。

3.将膜浸在氨基黑中着色5min

4.用脱色缓冲液脱色5min,4次。

5.完成后,将膜浸在封闭缓冲液中,室温封闭1h

 

六.抗体检测

1.用封闭缓冲液将稀释一抗,室温孵育一抗1h

2.用含0.05%Tween20TBS洗膜5mim,4次。

3.将二抗按所需比例稀释于封闭缓冲液中,室温孵育二抗1h

4.用含0.05%Tween20TBS洗膜5mim,4次。

5.用化学发光仪器检测。

 

.去除印记

1.用含0.05%Tween20PBS洗膜。

2.将膜放置于略大于膜的卡袋中。

3.加入5~10ml去除缓冲液。

4.尽可能的将空气赶出,密封袋子。

5.浸于80℃水浴中孵育20min。

6.用0.05%Tween20PBS洗膜。

7.Tween205%BSA封闭1h或含Tween203%BSA封闭过夜。

 

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